تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما
Summary
ويرد على بروتوكول فحص كفاءة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال في الخلايا الجذعية جليوبلاستوما (جسكس). ويستند المقايسة مراسل تمايز خلايا الجذعية حيث التعبير عن تعزيز التجارة والنقل (اجفب) بدافع المروج توصيني البشرية.
Abstract
جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والأكثر فتكاً في البالغين، مما تسبب في وفاة 14,000 تقريبا كل سنة في الولايات المتحدة وحدها. متوسط البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص أقل من 15 شهرا مع العلاج الكيميائي الاستئصال، والإشعاع، وتيموزولوميدي الجراحية القصوى. وقد أصبح واضحا بصورة متزايدة التحديات الكامنة في تطوير علاجات أكثر فعالية في الخليج للحاسبات الآلية، وتشمل اختزاع لا ينضب، ومقاومته للعلاجات القياسية، وتعقيد الوراثية والتكيف الجزيئي والفئات السكانية الفرعية من الخليج للحاسبات الآلية الخلايا مع التشابه المظهرية للخلايا الجذعية الطبيعية، يشار هنا إلى جليوبلاستوما الخلايا الجذعية (جسكس). لأن جسكس مطلوبة لنمو الورم والتقدم، يمثل العلاج القائم على التمييز بين طريقة معالجة ناجعة لهذه الأورام المستعصية.
البروتوكول التالية تصف مجموعة من الإجراءات إنشاء إنتاجية عالية فحص منصة تهدف إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال GSC. في جوهر هذا النظام الدبقية فيبريلاري حمضية بروتين (توصيني) تمايز مراسل-بناء. ويتضمن البروتوكول الإجراءات العامة التالية: (1) إنشاء خطوط مراسل التمايز غسك؛ (2) اختبار/التحقق من أهمية المراسل بالنسبة للقدرات الذاتية-تجديد/كلونوجينيك غسك؛ وتدفق عالية القدرة (3)-الخلوي على أساس فحص المخدرات.
منصة الفحص يوفر نهج بسيطة وغير مكلفة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز جسكس. وعلاوة على ذلك، استخدام المكتبات للأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وينطوي على إمكانية للتعرف على العوامل التي يمكن أن تكون أغراض أخرى أكثر سرعة. أيضا، يتوقع العلاجات التي تعزز سرطان الخلية الجذعية التمايز تآزر مع العلاجات “معيار الرعاية” الحالية التي أثبتت لاستهداف والقضاء على الدرجة الأولى أكثر من الخلايا السرطانية المتباينة.
Introduction
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أورام تحتوي على عدد صغير من سكان من الخلايا، وتسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) أو الشروع في ورم الخلايا، التي هي المسؤولة عن تطور الورم وورم خبيث، ومقاومة للعلاج الكيماوي وراديو 1، 2-وجود الخلايا الجذعية السرطانية وعلى نسلها أكثر تمايزاً داخل الأورام يعتبر عاملاً مهما في تعزيز عدم تجانس intratumoral وهكذا يمثل عقبة رئيسية في علاج السرطانات3. والهم التسلسل الهرمي لخلية الورم، قدمتها سرطان الخلية الجذعية من الناحية النظرية، وضع استراتيجيات جديدة لعلاج السرطان 4. نهج واحد لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية هو تحديد وتمنع المسارات مما يشير إلى أن من المعروف أن تكون مطلوبة خلال التطور الجنيني للجهاز المتأثر. في الواقع، نحن وآخرون قد نشرت سابقا أوراق متعددة تصف الاحتياجات الجارية ذات الصلة بالخلايا الجذعية إشارات المسارات العصبية القنفذ سونيك والشق في جليوبلاستوما5،،من67. وقد ساعد هذا العمل في توطيد الأساس المنطقي لعدة تجارب سريرية في الخليج للحاسبات الآلية. ثمة نهج ثان لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية تعزيز هذه التفرقة. هذا النهج قد تلقت الكثير من الدعم بسبب نتائج إيجابية من الدراسات السريرية والاكلينيكية في علاج اللوكيميا الحادة بروميلوسيتيك مع الأحماض الريتينويك (ATRA، بث فيتامين (أ)). هنا وجد ATRA إزالة كتلة النضوج وتعزيز سرطان الخلية التمايز8. في الآونة الأخيرة، بيكسيريلو والزملاء أناقة أظهرت أن BMP-4 يعزز التمايز غسك إلى astrocytes مع GBM مكافحة كبير الأثر في المختبر و في فيفو9.
الأساس المنطقي للدراسة الحالية تستند إلى نهج “عكس هندسة” لاستهداف جسكس. ونظرا لعدم تجانس الواسعة الحالية في الخليج للحاسبات الآلية ومع التمايز الفقيرة كونها واحدة من السمات المميزة للسرطان، سألنا إذا نحن يمكن أن تعزز النمط الظاهري أكثر إيجابية-التفريق في دولة مثل أستروسيتي. هنا، لم يكن لدينا علم مسبق بالممرات مما يشير إلى أن الحفاظ على جسكس في عينة ورم معين ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى تحقيق النمط الظاهري المطلوب (مثلاً توصيني الإيجابية).
ويصف هذا التقرير الإجراءات المستخدمة لإنشاء غسك التمايز مراسل خطوط من توصيل الثقافات إثراء غسك غسك اختيار الاستنساخ. تم إنشاء خطوط نيوروسفيري جليوبلاستوما المستخدمة في مختبر البروفيسور أنجيلو فيسكوفي من المرضى مع تشخيص جليوبلاستوما الأولية في “مستشفى سان رافائيل”-ميلانو، إيطاليا. وقد درست هذه الخطوط على نطاق واسع في عدة منشورات 6،10،،من1112،،من1314. يوصي بشدة أن الأفراد الذين يرغبون في تنفيذ هذه التقنيات في المختبر تحديد أهمية المراسل بالنسبة لسرطان الخلايا الجذعية الذاتي تجديد القدرات في الخلايا أنهم يخططون للدراسة (وهذا صحيح بالنسبة لأي مراسل). بروتوكول مفصل لواحدة من في المختبر كلونوجينيك فحوصات المقبولة في المجال يتم توفيرها لإنجاز هذا15،16. وأخيراً، يرد بروتوكول مفصلة تصف الاستفادة من التمايز المراسل الخطوط في شاشة المخدرات تدفق-الخلوي على أساس في النهاية. من المذكرة، وبالمثل إلى نظام التمايز أستروجليال الموصوفة هنا، لدينا بنجاح المنشأة والتحقق من صحة غسك مراسل خطوط دمج مراسل (تمايز الخلايا العصبية) MAP2:GFP. ولذلك، تصف المنهجيات في هذه الورقة يمكن تطبيقها على دراسة التمايز الخلوي إلى مختلف الخلايا الأنساب.
يمكن العثور على بعض الأرقام الواردة في هذا التقرير في منشور صدر مؤخرا: “اتراكوريوم بزيلات وغيرها من العوامل حظر الأعصاب تشجيع التمايز أستروجليال وتستنزف جليوبلاستوما الخلايا الجذعية البالغة18.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين أن معظم الدراسات السابقة من جسكس وركزت أساسا على العلامات التي تحدد لهم، في هذه الدراسة قررنا اتخاذ نهج عكسي. نحن تركز أساسا على نسلها متمايزة المتولدة عن جسكس (مثلاً، يعبر عن أستروجليال وعلامات العصبية الخلايا). هنا نظهر استخدام المخدرات إنتاجية عالية يستند إلى الخلية فحص النظام، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت هذا العمل تم جزئيا ب R01CA187780 المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
