流动 Cytometry-based 药物筛选系统对促进细胞分化胶质母细胞瘤小分子的鉴定
Summary
提出了一种有效的筛选方案, 以识别小分子, 促进形分化的胶质母细胞瘤干细胞 (GSCs)。该检测是基于一个干细胞分化的记者, 即增强 GFP (eGFP) 的表达是由人胶质细胞促进剂驱动。
Abstract
胶质母细胞瘤是成人最常见和最致命的原发性脑瘤, 仅在美国每年造成大约1.4万人死亡。术后存活中位数少于15月, 最大手术切除、放疗、莫化疗。发展更有效的大紫荆治疗所固有的挑战已变得越来越明显, 包括其不屈的侵袭性, 它对标准治疗的抵抗, 其遗传复杂性和分子适应性, 和亚大紫荆与正常干细胞有表型相似的细胞, 这里称为胶质母细胞瘤干细胞 (GSCs)。由于 GSCs 是肿瘤生长和进展所必需的, differentiation-based 治疗是这些不治之症的一种可行的治疗方式。
下面的协议描述了建立一个高通量筛选平台的程序集合, 旨在识别促进 GSC 形分化的小分子。在该系统的核心是一个胶质纤维酸性蛋白 (胶质细胞) 分化的记者-构造。本议定书载有下列一般程序: (1) 建立 GSC 分化的记者行;(2) 测试/验证记者对 GSC 自我更新/克隆能力的相关性;和 (3) 高容量流式细胞仪基础药物筛选。
筛选平台提供了一种简单而廉价的方法来识别促进 GSCs 分化的小分子。此外, 利用 FDA 批准的药物库, 有可能识别能更快地进行用途的制剂。此外, 促进癌症干细胞分化的疗法有望与目前的 “护理标准” 治疗方法协同工作, 这些疗法已被证明是针对和消除主要分化的癌细胞。
Introduction
最近的研究表明, 肿瘤中含有少量的细胞, 称为癌症干细胞 (协会) 或肿瘤启动细胞, 它们负责肿瘤的进展、转移以及对化疗和无线电治疗的抵抗力1,2. 肿瘤干细胞及其分化后代的存在被认为是促进瘤内异质性的重要因素, 因此是治疗癌症的主要障碍3。肿瘤细胞的层次, 由癌症干细胞理论提供, 启发了新的治疗癌症的策略的发展4。一种靶向肿瘤干细胞的方法是识别和抑制在胚胎发育过程中已知需要的信号通路。事实上, 我们和其他人以前发表过多篇论文, 描述了对神经干细胞相关信号通路的持续需求, 在胶质母细胞瘤中的声波刺猬和凹槽5,6,7。这项工作有助于巩固的理由, 几个肾小球临床试验。第二种靶向肿瘤干细胞的方法是促进其分化。这种方法得到了很多的支持, 由于良好的结果, 从前临床研究和治疗急性早幼粒细胞白血病的维甲酸 (ATRA, 维生素 a 模拟)。这里 ATRA 被发现去除成熟块和促进肿瘤细胞分化8。最近, Piccirillo 和同事已经优雅地表明, BMP-4 促进 GSC 分化为星形胶质细胞具有显著的抗大膜效应体外和体内9。
目前研究的基本原理是基于针对 GSCs 的 “逆向工程” 方法。鉴于大紫荆存在巨大的异质性, 且分化程度差是癌症的标志之一, 我们问是否可以促进一种更有利的表型分化成星形胶质细胞样的状态。在这里, 我们没有先验知识的信号通路, 维持 GSCs 在一个给定的肿瘤标本, 而是目标, 以达到预期的表型 (如胶质细胞阳性)。
本报告描述的程序, 建立 GSC 分化记者线从 GSC 丰富的文化转介到 GSC 克隆选择。使用的胶质母细胞瘤干细胞线是建立在实验室的安吉洛教授 Vescovi 从诊断原发性胶质瘤在医院圣拉斐尔-米兰, 意大利。这些线路已在多个出版物中广泛研究6、10、11、12、13、14。强烈建议那些有兴趣在实验室中实施这些技术的个人, 确定记者在他们计划研究的细胞中对癌症干细胞自我更新能力的相关性 (这对任何记者都是如此)。为完成此15、16提供了一个在该字段中接受的体外克隆分析的详细协议。最后, 给出了一个详细的协议, 描述了在流式细胞仪的药物屏幕上区分记者线的使用。值得注意的是, 类似于这里描述的形微分系统, 我们已经成功地建立并验证了 GSC 记者的 MAP2:GFP (神经元分化) 报告者的线。因此, 本文所描述的方法可以用于研究细胞分化为各种细胞谱系。
本报告中的一些数字可以在最近的出版物中找到: “阿曲库磺和其他神经肌肉阻滞剂促进形分化和消耗胶质母细胞瘤干细胞18。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然以前的大多数 GSCs 研究主要集中在定义它们的标记上, 但在这项研究中, 我们决定采取逆向方法。我们主要关注 GSCs 产生的分化后代 (例如, 表达形和神经元标记的细胞)。在这里, 我们展示了一个基于细胞的高通量药物筛选系统的利用, 这是建立在人胶质蛋白的启动依赖的 GFP 表达。所有的实验都是利用患者衍生的干细胞胶质瘤细胞系进行的。加利et al17中描述了描述这些…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了 NIH R01CA187780 的部分支持。
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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