ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं के सेलुलर भेदभाव को बढ़ावा देने कि छोटे अणुओं की पहचान के लिए प्रवाह Cytometry आधारित दवा स्क्रीनिंग प्रणाली
Summary
एक कुशल स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल छोटे अणुओं है कि ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) में astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के लिए प्रस्तुत किया है । परख एक स्टेम सेल भेदभाव रिपोर्टर जिससे बढ़ाया GFP (eGFP) की अभिव्यक्ति मानव GFAP प्रवर्तक से प्रेरित है पर आधारित है ।
Abstract
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) वयस्कों में सबसे आम और सबसे घातक प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर है, मोटे तौर पर अकेले अमेरिका में १४,००० मौतें हर साल होता है । माध्य अस्तित्व के बाद निदान अधिक से अधिक सर्जिकल लकीर, विकिरण, और temozolomide कीमोथेरेपी के साथ 15 महीने से भी कम है । अधिक प्रभावी जीबीएम उपचार के विकास में निहित चुनौतियों का तेजी से स्पष्ट हो गया है, और अपनी झुकते इनवेसिव, मानक उपचार के लिए अपने प्रतिरोध, अपनी आनुवंशिक जटिलता और आणविक अनुकूलन क्षमता, और जीबीएम की उपआबादी शामिल सामान्य स्टेम कोशिकाओं के लिए phenotypic समानता के साथ कोशिकाओं, इस के साथ साथ ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम सेल (GSCs) के रूप में भेजा. क्योंकि GSCs ट्यूमर विकास और प्रगति के लिए आवश्यक हैं, भेदभाव आधारित चिकित्सा इन लाइलाज ट्यूमर के लिए एक व्यवहार्य उपचार रूपरेखा का प्रतिनिधित्व करता है ।
निंनलिखित प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं का एक संग्रह का वर्णन एक उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग छोटे अणुओं है कि GSC astroglial भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान के उद्देश्य से मंच स्थापित करने के लिए । प्रणाली के मूल में एक glial fibrillary अंलीय प्रोटीन (GFAP) भेदभाव रिपोर्टर-निर्माण है । प्रोटोकॉल में निंनलिखित सामांय कार्यविधियां हैं: (1) GSC विभेदन रिपोर्टर लाइनें स्थापित करना; (2) GSC स्व-नवीकरण/clonogenic क्षमता के लिए रिपोर्टर की प्रासंगिकता को सत्यापित करने के लिए परीक्षण/ और (३) उच्च क्षमता वाली प्रवाह-cytometry आधारित औषध स्क्रीनिंग.
स्क्रीनिंग मंच एक सीधी और सस्ती दृष्टिकोण प्रदान करता है छोटे अणुओं है कि GSCs भेदभाव को बढ़ावा देने की पहचान । इसके अलावा, एफडीए अनुमोदित दवाओं के पुस्तकालयों का उपयोग एजेंटों की पहचान है कि अधिक तेजी से reपर्पज किया जा सकता है के लिए क्षमता रखती है । इसके अलावा, उपचार है कि कैंसर को बढ़ावा देने के सेल विभेद स्टेम वर्तमान के साथ synergistically काम करने की उंमीद कर रहे है “देखभाल के मानक” चिकित्सा कि लक्ष्य और मुख्य रूप से अधिक विभेदित कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए दिखाया गया है ।
Introduction
हाल के अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी होते हैं, कैंसर स्टेम सेल (सीएससीएस) या ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं, जो ट्यूमर प्रगति, मेटास्टेसिस, और chemo के प्रतिरोध के लिए जिंमेदार है-और रेडियो- 1चिकित्सा, 2. कैंसर की उपस्थिति स्टेम कोशिकाओं और उनके ट्यूमर के भीतर अधिक विभेदित जिन्नों intratumoral विविधता को बढ़ावा देने के एक महत्वपूर्ण कारक माना जाता है और इस प्रकार3कैंसर के इलाज में एक बड़ी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है । ट्यूमर कोशिका पदानुक्रम, कैंसर स्टेम सेल सिद्धांत द्वारा प्रदान की गई है, नई रणनीतियों के विकास के लिए प्रेरित किया है 4कैंसर का इलाज । कैंसर को लक्षित करने के लिए एक दृष्टिकोण स्टेम सेल की पहचान करने और संकेत रास्ते है कि प्रभावित अंग के भ्रूण विकास के दौरान आवश्यक हो जाना जाता है रोकना है । दरअसल, हम और दूसरों को पहले से कई के लिए चल रही आवश्यकता का वर्णन कागजात प्रकाशित किया है स्टेम सेल-प्रासंगिक संकेतन रास्ते ध्वनि हेज हॉग और ग्लियोब्लास्टोमा में पायदान5,6,7। इस काम के कई जीबीएम नैदानिक परीक्षणों के लिए तर्क जमना में मदद मिली है । कैंसर स्टेम सेल लक्ष्यीकरण के लिए एक दूसरा दृष्टिकोण को अपने विभेद को बढ़ावा देने है । यह दृष्टिकोण retinoic एसिड (अतरा, एक विटामिन-एक एनालॉग) के साथ तीव्र promyelocytic ल्यूकेमिया के इलाज में नैदानिक और नैदानिक अध्ययनों से अनुकूल परिणाम के कारण समर्थन का एक बहुत कुछ प्राप्त हुआ है । यहां अतरा के लिए परिपक्वता ब्लॉक हटाने और कैंसर सेल विभेद8को बढ़ावा मिला था । हाल ही में, Piccirillo और सहकर्मियों को खूबसूरती से पता चला है कि BMP-4 astrocytes में महत्वपूर्ण विरोधी जीबीएम प्रभाव के साथ और vivo में9में GSC भेदभाव को बढ़ावा देता है ।
वर्तमान अध्ययन के लिए तर्क GSCs लक्ष्यीकरण के लिए एक “उलट इंजीनियरिंग” दृष्टिकोण पर आधारित है । जीबीएम में विशाल विविधता वर्तमान को देखते हुए और गरीब भेदभाव कैंसर की पहचान में से एक होने के साथ, हमने पूछा कि क्या हम एक astrocyte की तरह राज्य में एक और अधिक अनुकूल phenotype-भेदभाव को बढ़ावा देने सकता है । यहाँ, हम एक दिया ट्यूमर नमूना में GSCs बनाए रखने के संकेत रास्ते की पूर्व ज्ञान नहीं है, लेकिन बल्कि एक वांछित phenotype (उदाहरण के लिए GFAP धनात्मकता) को प्राप्त करने के लिए उद्देश्य.
इस रिपोर्ट में GSC-समृद्ध संस्कृतियों के transduction से GSC विभेदक रिपोर्टर-लाइनें स्थापित करने के लिए प्रयुक्त प्रक्रियाओं का वर्णन GSC क्लोनल चयन के लिए किया गया है । ग्लियोब्लास्टोमा neurosphere इस्तेमाल किया लाइनों अस्पताल San Raffaele में प्राथमिक ग्लियोब्लास्टोमा के निदान के साथ रोगियों से प्रोफेसर एंजेलो Vescovi की प्रयोगशाला में स्थापित किया गया-मिलानो, इटली । इन पंक्तियों में बड़े पैमाने पर कई प्रकाशनों 6,10,11,12,13,14में अध्ययन किया गया है । यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि व्यक्तियों, जो अपनी प्रयोगशाला में इन तकनीकों को लागू करने में रुचि रखते है रिपोर्टर की प्रासंगिकता कैंसर स्टेम सेल स्वयं कोशिकाओं वे अध्ययन करने की योजना में नवीकरण क्षमता का निर्धारण (यह किसी भी रिपोर्टर के लिए सच है) । इन विट्रो clonogenic में से एक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल क्षेत्र में स्वीकार किए जाते है परख इस15,16पूरा करने के लिए प्रदान की जाती है । अंत में, एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक प्रवाह-cytometry आधारित दवा स्क्रीन में भिंनता रिपोर्टर लाइनों के उपयोग का वर्णन अंत में प्रदान की जाती है । नोट की, इसी तरह astroglial भेदभाव प्रणाली के लिए यहां वर्णित है, हम सफलतापूर्वक स्थापित किया है और पुष्टि GSC रिपोर्टर एक MAP2: GFP (न्यूरॉन भेदभाव) रिपोर्टर लाइनों को एकीकृत । इसलिए, इस पत्र में वर्णन के तरीके विभिंन कोशिका वंश में सेलुलर भेदभाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
इस रिपोर्ट में कुछ आंकड़े हाल ही में एक प्रकाशन में पाया जा सकता है: “Atracurium Besylate और अंय neuromuscular ब्लॉकिंग एजेंटों astroglial भेदभाव और गिरेगा ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम कोशिकाओं को बढ़ावा देने के18।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि GSCs के पिछले अध्ययनों के सबसे मुख्य रूप से मार्करों कि उंहें परिभाषित पर ध्यान केंद्रित, इस अध्ययन में हम रिवर्स दृष्टिकोण लेने का फैसला किया । हम GSCs द्वारा उत्पन्न विभेदित जिन्नों पर मुख्य रूप से ध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को आंशिक रूप से NIH R01CA187780 ने समर्थन दिया है ।
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
