Farmaco a base di citometria a flusso sistema di Screening per l'identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione cellulare delle cellule staminali di Glioblastoma
Summary
Un protocollo di screening efficiente è presentato per l’identificazione di piccole molecole che promuovono astroglial differenziazione in cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Il dosaggio è basato su un reporter di differenziazione di cellule staminali per cui l’espressione della GFP avanzata (eGFP) è guidato da promotore umano di GFAP.
Abstract
Glioblastoma (GBM) è il tumore cerebrale primario più comune e più letali negli adulti, provocando circa 14.000 morti ogni anno nei soli Stati Uniti. La sopravvivenza mediana dopo la diagnosi è meno di 15 mesi con massima chemioterapia chirurgico di resezione, radioterapia e temozolomide. Le sfide inerenti lo sviluppo di trattamenti più efficaci di GBM sono diventati sempre più chiare e includono la sua invasività inflessibile, la resistenza ai trattamenti standard, sua complessità genetica e molecolare adattabilità e sottopopolazioni di GBM cellule con somiglianze fenotipiche delle cellule staminali normali, riferito come le cellule staminali di glioblastoma (artigiano). Perché artigiano è necessari per la progressione e la crescita del tumore, terapia a base di differenziazione rappresenta una modalità di trattamento vitale per questi neoplasma incurabile.
Il seguente protocollo descrive un insieme di procedure per stabilire un throughput elevato piattaforma, finalizzato all’identificazione di piccole molecole che promuovono la differenziazione di GSC astroglial di screening. Il nucleo del sistema è un reporter-costrutto di differenziazione di proteina silicea fibrillare glial (GFAP). Il protocollo contiene le procedure generali seguenti: (1) stabilire GSC differenziazione reporter linee; (2) test/convalida la rilevanza del reporter alla capacità di auto-rinnovamento/clonogenic GSC; e lo screening di stupefacenti basato di citometria a flusso ad alta capacità (3).
La piattaforma di screening fornisce un approccio semplice e poco costoso per identificare piccole molecole che promuovono la differenziazione di artigiano. Inoltre, l’utilizzo di librerie di farmaci approvati dalla FDA possiede il potenziale per l’identificazione degli agenti che possono essere riutilizzati più rapidamente. Inoltre, terapie che promuovono la differenziazione delle cellule staminali del cancro devono lavorare in sinergia con le terapie “standard di cura” che sono state indicate per mirare ed eliminare soprattutto più cellule di cancro differenziato.
Introduction
Recenti studi hanno dimostrato che i tumori contengono una piccola popolazione di cellule, chiamate cellule staminali tumorali (CSC) o cellule d’inizio del tumore, che sono responsabili della progressione del tumore, metastasi e resistenza alla chemio – e radio-terapie 1, 2. la presenza di cellule staminali tumorali e loro progenie differenziate all’interno dei tumori è considerata un fattore importante promuovere eterogeneità intratumorale e rappresenta quindi una transenna importante nel trattamento di tumori3. Gerarchia delle cellule di tumore, fornita dalla teoria di cellule staminali del cancro, ha ispirato lo sviluppo di nuove strategie per trattare tumori 4. Un approccio per mirare alle cellule staminali tumorali è di identificare e inibire le vie di segnalazione che sono noti per essere richiesto durante lo sviluppo embrionale dell’organo colpito. Infatti, noi ed altri abbiamo precedentemente pubblicato più documenti che descrivono il requisito in corso di cellule staminali-pertinenti segnalazione percorsi neurali Sonic Hedgehog e Notch in glioblastoma5,6,7. Questo lavoro ha aiutato a solidificarsi la spiegazione razionale per parecchi test clinici di GBM. Un secondo approccio per mirare alle cellule staminali tumorali è quello di promuovere la loro differenziazione. Questo approccio ha ricevuto un sacco di supporto dovuto i risultati favorevoli da studi preclinici e clinici nel trattamento della leucemia promyelocytic acuta con l’acido retinoico (ATRA, un analogo della vitamina A). Qui ATRA è stato trovato per rimuovere il blocco di maturazione e promuovere il cancro cellula differenziazione8. Più recentemente, Piccirillo e colleghi hanno elegantemente dimostrato che BMP-4 promuove la differenziazione di GSC in astrocytes con anti-GBM significativi effetti in vitro e in vivo9.
Il razionale per lo studio corrente si basa su un approccio di “ingegneria inversa” per il targeting artigiano. Data l’eterogeneità di vasto presente nel GBM e con scarsa differenziazione essendo uno dei tratti distintivi del cancro, abbiamo chiesto se ci potrebbe promuovere un fenotipo più favorevole – differenziazione in uno stato simil-astrociti. Qui, non abbiamo conoscenza preventiva delle vie di segnalazione che mantenere artigiano in un esemplare del tumore determinato ma piuttosto mirare a raggiungere un fenotipo desiderato (ad es. positività GFAP).
Questo rapporto descrive le procedure utilizzate per stabilire GSC differenziazione reporter-linee dalla trasduzione delle culture GSC-arricchita per selezione clonale GSC. Le linee di glioblastoma neurosphere utilizzate sono state stabilite al laboratorio del Professor Angelo Vescovi da pazienti con una diagnosi di glioblastoma primario presso l’ospedale San Raffaele – Milano, Italia. Queste linee sono state studiate estesamente in diverse pubblicazioni 6,10,11,12,13,14. È altamente raccomandato che gli individui che sono interessati a implementare queste tecniche nel loro laboratorio di determinano la rilevanza del reporter per capacità di auto-rinnovamento delle cellule staminali del cancro nelle cellule hanno in programma di studiare (questo è vero per qualsiasi giornalista). Un protocollo dettagliato per uno dell’analisi in vitro clonogenic accettate nel campo è fornito per compire questo15,16. Infine, un protocollo dettagliato che descrive l’utilizzo delle differenziazione reporter-linee in uno schermo di droga di citometria a flusso basato è fornito alla fine. Di nota, allo stesso modo per il sistema di differenziazione astroglial descritto qui, abbiamo con successo stabilito e convalidato linee reporter GSC l’integrazione di un reporter di MAP2:GFP (differenziamento neuronale). Pertanto, le metodologie di descrivere in questa carta può essere applicata per studiare la differenziazione cellulare in varie linee cellulari.
Alcune delle figure in questo rapporto può essere trovato in una recente pubblicazione: “Atracurium Besylate e altri agenti di blocco neuromuscolare promuovere il differenziamento astrogliale e impoveriscono glioblastoma cellule staminali18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la maggior parte degli studi precedenti di artigiano focalizzata principalmente sui marcatori che li definiscono, in questo studio abbiamo deciso di adottare l’approccio inverso. Ci concentriamo principalmente sulla progenie differenziate generate da artigiano (per esempio, le cellule che esprimono astroglial e marcatori neuronali). Qui dimostriamo l’utilizzazione di un sistema, che è basato sulla espressione umana del promotore-dipendente GFAP di GFP di screening di stupefacenti basati su celle a resa elevata. T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata parzialmente sostenuta da NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
