교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사
Summary
효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.
Abstract
세포종 (GBM)은 미국 에서만 매년 약 14000 죽음을 일으키는 원인이 되는 성인에서 가장 일반적이 고 가장 치명적인 기본 뇌 종양. 메디아 생존 진단 다음 최대한 외과 절제술, 방사선 및 temozolomide 요법으로 15 개월 미만 이다. 더 효과적인 GBM 치료법 개발에 도전 점점 더 분명 되 고 등의 탄력성이 침입, 표준 치료에 그것의 저항, 그것의 복잡 한 유전 및 분자 적응성, GBM의 모집단 정상 줄기 세포, phenotypic 유사성과 셀 본 세포종 줄기 세포 (GSCs) 라고. GSCs 종양 성장 및 진행을 위해 필요 하기 때문에 차별화에 기초를 둔 치료가 불 치의 신생에 대 한 가능한 치료 양식 적임을 나타냅니다.
다음 프로토콜 플랫폼 GSC astroglial 차별화를 홍보 하는 작은 분자의 식별 목적으로 상영 높은 처리량을 설정 하는 절차의 컬렉션을 설명 합니다. 시스템의 핵심에는 폐해 fibrillary 산 성 단백질 (GFAP) 차별화 기자-구문입니다. 다음과 같은 일반적인 절차를 포함 하는 프로토콜: (1) 설립 GSC 차별화 기자 라인; (2) 테스트/유효성 검사 GSC 자체-갱신/clonogenic 용량; 기자의 관련성 그리고 (3) 높은-용량 cytometry 마약 검사를 기반으로.
심사 플랫폼 GSCs 차별화를 홍보 하는 작은 분자를 식별 하는 간단 하 고 저렴 한 접근을 제공 합니다. 또한, FDA 승인 약품의 라이브러리의 활용 더 급속 하 게 내리거나 수 에이전트의 식별에 대 한 가능성을 보유 하고있다. 또한, 암 줄기 세포 분화를 촉진 하는 치료 대상 및 주로 더 차별화 된 암 세포를 제거 하기 위해 표시 되었습니다 현재 “표준 치료” 치료 공동 성으로 작동 하도록 예상 된다.
Introduction
최근 연구는 작은 인구를 포함 하는 종양 세포, 암 줄기 세포 (CSCs) 또는 시작 하는 종양 세포 나의 종양 진행, 전이, 그리고 항 암 치료 및 라디오 치료 1, 저항에 대 한 책임은 2. 암 줄기 세포 및 종양 내의 그들의 분화 progenies intratumoral이 추진 하는 중요 한 요소를 간주 하 고 따라서 암3치료에 주요 장애물을 나타냅니다. 종양 세포 계층, 암 줄기 세포 이론에 의해 제공 된 치료 암 4새로운 전략의 개발 영감 하고있다. 암 줄기 세포를 대상으로 하는 한 가지 방법은 식별 하 고 영향을 받는 장기의 배아 발달 동안에 필요한 것으로 알려져 있습니다 신호 경로 억제 하는 것입니다. 사실, 우리와 다른 사람 신경 줄기 세포 관련 신호 경로 소닉 고슴도치와 노치 세포종5,,67에 대 한 지속적인 요구를 설명 하는 여러 논문을 출판 이전 했습니다. 이 작품은 여러 GBM 임상 시험에 대 한 근거를 응고에 도움이 되었습니다. 암 줄기 세포를 대상으로 두 번째 방법은 그들의 차별화 홍보 하는 것입니다. 이 방법은 retinoic 산 (ATRA, 비타민 A 아날로그)와 급성 promyelocytic 백혈병 치료에 전 임상 및 임상 연구에서 유리한 결과로 인해 지원 많이 받았습니다. 여기 ATRA 성숙 블록을 제거 하 고 암 세포 감 별 법8촉진 발견 됐다. 더 최근에, Piccirillo와 동료 우아하게 나타났습니다 BMP-4 중요 한 안티-GBM 효과 생체 외에서 그리고 vivo에서9이다에 GSC 차별화를 촉진.
현재 연구에 대 한 근거 GSCs를 대상으로 “역된 공학” 접근을 기반으로 합니다. GBM와 암의 특징 중 하나 되 고 불 쌍 한 차별화와 광대 한이 감안할 때, 우리는 경우 우리는 호의 베푸는 표현 형-사이토와 같은 상태로 차별화 홍보 수 물었다. 여기, 우리가 특정된 종양 견본에서 GSCs를 유지 하지만 오히려 원하는 표현 형 (예: GFAP 양성) 달성을 목표로 하는 신호 통로의 사전 지식이 필요가 없습니다.
이 보고서는 GSC 차별화 기자-라인 GSC 농축 문화 변환에서 GSC 클론 선택 영역을 설정 하는 데 사용 하는 절차를 설명 합니다. 세포종 neurosphere 라인 사용 병원 산 라파엘 레-밀라노, 이탈리아에서 기본 세포종의 진단 가진 환자에서 교수 안젤로 Vescovi의 실험실에서 설립 되었다. 이 라인은 여러 간행물 6,10,,1112,13,14에서 광범위 하 게 연구 되었습니다. 그들의 실험실에서 이러한 기술을 구현에 관심이 있는 개인 공부를 계획 하는 세포에서 암 줄기 세포 자체 갱신 용량 기자의 관련성 확인 것이 좋습니다 (이 어떤 기자). 생체 외에서 clonogenic 분석 실험은 분야에서 허용 중 하나에 대 한 자세한 프로토콜이15,16을 달성 하기 위해 제공 됩니다. 마지막으로, cytometry 기반 약 스크린에 차별화 기자-라인의 활용을 설명 하는 상세한 프로토콜 끝에 제공 됩니다. 노트, 마찬가지로 astroglial 차별화 시스템 설명, 우리 성공적으로 설립 하 고 GSC 기자 라인 MAP2:GFP (신경 분화) 기자를 통합 검증. 따라서,이 방법론 설명 종이 다양 한 세포 계보에 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.
이 보고서에 있는 숫자 중 일부는 최근 간행물에서 찾을 수 있습니다: “Atracurium Besylate 다른 신경 근육 차단 에이전트 astroglial 차별화 홍보 및 세포종 줄기 세포18고갈.
Protocol
Representative Results
Discussion
그들을 정의 하는 표식에 주로 집중 하는 GSCs의 이전 연구의 대부분,이 연구에서 우리가 결정 역 접근 하는 것. 우리는 GSCs (예를 들어, 셀 astroglial와 신경 마커)에 의해 생성 된 차별화 된 progenies에 주로 집중 한다. 여기 우리 인간의 GFAP 발기인 종속 식을 GFP의 기반 시스템 심사 높은 처리량 셀 기반 약물의 사용을 보여 줍니다. 모든 실험 환자 파생 neurosphere 세포종 세포 라인을 활용 하 여 수행 했다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01CA187780에 의해 부분적으로 지원 되었습니다.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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