Flow cytometri-baserte narkotika Screening System for identifisering av små molekyler som fremmer differensiering av glioblastom stilk celler
Summary
En effektiv screening protokoll er presentert for identifikasjon av små molekyler som fremmer astroglial differensiering i glioblastom stilk celler (GSCs). Analysen er basert på en stilk cellen differensiering reporter der uttrykket av den forbedrede GFP (eGFP) er drevet av menneskelig GFAP selskapet.
Abstract
Glioblastom (GBM) er den vanligste og mest dødelige primære hjernesvulst hos voksne, forårsaker omtrent 14 000 dødsfall hvert år i USA alene. Median overlevelse etter diagnose er mindre enn 15 måneder med maksimal kirurgisk resection, stråling og temozolomide kjemoterapi. Utfordringene som er iboende i å utvikle mer effektive GBM behandlinger har blitt stadig klarere, og inkluderer sin urokkelige invasiveness, sin motstand mot standard behandlinger, genetiske kompleksitet og molekylære tilpasningsevne og subpopulasjoner av GBM celler med fenotypiske likheter vanlig stamceller, heretter referert til som glioblastom stamceller (GSCs). Fordi GSCs er nødvendig for tumor vekst og progresjon, representerer differensiering-basert terapi en levedyktig behandling modalitet for disse uhelbredelig neoplasms.
Følgende protokollen beskriver en samling prosedyrer å etablere en høy gjennomstrømning screening plattform rettet mot identifikasjon av små molekyler som fremmer GSC astroglial differensiering. Kjernen i systemet er en glial fibrillary Sure protein (GFAP) differensiering reporter-konstruksjon. Protokollen inneholder følgende generelle prosedyrer: (1) å etablere GSC differensiering reporter linjer; (2) testing/validere relevans av reporteren GSC self-fornyelse/clonogenic kapasitet; og (3) høykapasitets flowcytometri basert narkotikarelaterte screening.
Screening plattformen gir en enkel og rimelig tilnærming for å identifisere små molekyler som fremmer GSCs differensiering. Videre har utnyttelse av biblioteker av FDA-godkjent narkotika potensialet for identifikasjon av agenter som kan gjenproduseres raskere. Også forventes terapi som fremmer kreft stamcelleforskningen differensiering å jobber gjeldende “standard omsorg” behandling som har vist seg å målrette og eliminere primært mer differensiert kreftceller.
Introduction
Nyere studier har vist at svulster inneholder en liten populasjon av celler, kalt stilk celler (CSCs) eller svulst-starte celler, som er ansvarlig for svulst progresjon og metastasering motstand mot kjemoterapi – og radio-behandling 1, 2. kreft stamceller og deres mer differensiert progenies innen svulster er ansett som en viktig faktor å fremme intratumoral heterogenitet og dermed representerer et stort hinder i behandling av kreft3. Svulst celle hierarki, levert av kreft stamcelleforskningen teorien, har inspirert til utviklingen av nye strategier for å behandle kreft 4. En tilnærming for målretting stilk celler er å identifisere og hemme signalveier som kan være nødvendig under embryonale utviklingen av berørte organ. Faktisk har vi og andre tidligere publisert flere artikler som beskriver pågående kravet for de nevrale stamceller relevante signalveier soniske pinnsvin og hakk i glioblastom5,6,7. Dette arbeidet har bidratt i solidifying begrunnelsen for flere GBM kliniske studier. En annen tilnærming for å målrette stilk celler er å fremme deres differensiering. Denne tilnærmingen har fått mye støtte på grunn av gode resultater fra prekliniske og kliniske studier i behandling av akutt promyelocytic leukemi med retinoic syre (ATRA, en vitamin-A analog). Her fant ATRA fjerne modning blokken og fremme kreft cellen differensiering8. Flere nylig, Piccirillo og kolleger har elegant vist at BMP-4 fremmer GSC differensiering inn astrocyttene med betydelig anti-GBM effekter i vitro og vivo9.
Begrunnelsen for denne studien er basert på en “omvendt engineering” tilnærming for målretting GSCs. Gitt den enorme heterogenitet i GBM og med dårlig differensiering er ett av kjennetegnene av kreft, spurte vi om vi kunne fremme en gunstigere fenotypen – differensiering inn en astrocytter-lignende tilstand. Her har vi ikke forkunnskaper i signalveier som opprettholde GSCs i en gitt svulst prøven, men heller sikte på å oppnå en ønsket fenotypen (f.eks GFAP positivitet).
Denne rapporten beskriver fremgangsmåtene brukes til å opprette GSC differensiering reporter-linjer fra signaltransduksjon GSC-beriket kulturer GSC klonal utvalg. Glioblastom neurosphere linjene brukes ble etablert ved Professor Angelo Vescovi fra pasienter med diagnosen primære glioblastom ved sykehuset San Raffaele – Milano, Italia. Disse linjene har vært grundig studert i flere publikasjoner 6,10,11,12,13,14. Det anbefales sterkt at personer som er interessert i å implementere disse teknikkene i sitt laboratorium bestemmer relevansen av reporteren kreft stamcelleforskningen selvtillit fornyelse kapasitet i cellene de planlegger å studere (Dette gjelder for alle reporter). En detaljert protokoll for en av de i vitro clonogenic analyser i feltet tilbys for å oppnå denne15,16. Endelig gis en detaljert protokoll som beskriver bruken av differensiering reporter-linjene i en flowcytometri-basert narkotika skjerm på slutten. Av notatet, har tilsvarende astroglial differensiering systemet beskrevet her, vi opprettet og validert GSC reporter linjer integrere en MAP2:GFP (neuronal differensiering) reporter. Derfor metodikkene beskriver i dette papir brukes til å studere differensiering i forskjellige celle linjene.
Noen av tallene i denne rapporten finnes i en fersk publikasjon: “Atracurium Besylate og andre nevromuskulære blokkere agenter fremme astroglial differensiering og tømme glioblastom stamceller18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens de fleste av de tidligere studiene av GSCs fokusert primært på indikatorene som definerer dem, i denne studien besluttet vi å ta motsatt tilnærming. Vi fokuserer primært på de differensiert progenies generert av GSCs (f.eks celler uttrykke astroglial og neuronal markører). Her viser vi utnyttelsen av et cellebasert høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening system, som er basert på menneskelige GFAP promoter-avhengige uttrykk for GFP. Alle forsøkene ble utført utnytte pasient-avledede neurosphere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet har vært delvis støttet av NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
