Drogas baseada em citometria de fluxo sistema de triagem para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação celular de células-tronco Glioblastoma
Summary
Um protocolo de triagem eficiente é apresentado para a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de Ralevic em células-tronco glioblastoma (GSCs). O ensaio baseia-se em um repórter de diferenciação de células-tronco no qual a expressão da GFP reforçada (eGFP) é conduzida pelo promotor GFAP humano.
Abstract
Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e mais letal em adultos, causando cerca de 14.000 mortes a cada ano só nos EUA. Sobrevida média após o diagnóstico é menor que 15 meses com quimioterapia máxima de temozolomide, radiação e ressecção cirúrgica. Os desafios inerentes ao desenvolvimento de tratamentos mais eficazes de GBM tornaram-se cada vez mais claros e incluem sua invasividade inflexível, sua resistência aos tratamentos padrão, sua complexidade genética e molecular adaptabilidade e subpopulações de GBM células com semelhanças fenotípicas de células-tronco normais, doravante conhecido como glioblastoma as células-tronco (GSCs). Porque GSCs são necessários para o crescimento do tumor e progressão, terapia baseada em diferenciação representa uma modalidade de tratamento viável para estas Neoplasias incuráveis.
O seguinte protocolo descreve uma coleção de procedimentos para estabelecer um alto throughput plataforma vista a identificação de pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSC Ralevic de triagem. No núcleo do sistema é uma proteína ácida fibrilar glial (GFAP) repórter-construção de diferenciação. O protocolo contém os seguintes procedimentos gerais: (1) estabelecer linhas de repórter GSC diferenciação; (2) testar/validar a relevância do repórter, a capacidade de autorenovação / clonogenic GSC; e triagem de drogas de alta capacidade-citometria de fluxo com base (3).
A plataforma de triagem fornece uma abordagem simples e barata para identificar pequenas moléculas que promovem a diferenciação de GSCs. Além disso, a utilização de bibliotecas de drogas FDA-approved possui o potencial para a identificação dos agentes que pode ser reaproveitado mais rapidamente. Também, terapias que promovem a diferenciação de células-tronco de câncer são esperadas para trabalhar em sinergia com a atual terapias “padrão de cuidados” que foram mostradas para atacar e eliminar as células do câncer diferenciado principalmente mais.
Introduction
Estudos recentes têm mostrado que os tumores contêm uma pequena população de células, denominadas células-tronco câncer (CSCs) ou células de tumor-iniciando, que são responsáveis pela progressão do tumor, metástase e resistência à quimioterapia e radio-terapias 1, 2. a presença de câncer células-tronco e suas progênies mais diferenciados dentro de tumores é considerada fator importante promover a heterogeneidade intratumoral e, portanto, representa um grande obstáculo no tratamento de câncer3. Hierarquia de células de tumor, fornecida pela teoria de células-tronco do câncer, inspirou o desenvolvimento de novas estratégias para tratar cancros 4. Uma abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é identificar e inibir vias de sinalização que são conhecidas por serem necessárias durante o desenvolvimento embrionário do órgão afetado. Na verdade, nós e os outros anteriormente publicaram vários artigos descrevendo a exigência em curso para as células-tronco-relevantes sinalização vias neurais Sonic Hedgehog e entalhe em glioblastoma5,6,7. Este trabalho tem ajudado no solidificando a justificativa para vários ensaios clínicos de GBM. Uma segunda abordagem para o direcionamento de câncer células-tronco é promover a sua diferenciação. Esta abordagem tem recebido muito apoio devido os resultados favoráveis de estudos pré-clínicos e clínicos no tratamento da leucemia promielocítica aguda com ácidos retinoico (ATRA, um análogo da vitamina A). Aqui ATRA foi encontrado para remover o bloco de maturação e promover câncer de diferenciação celular8. Mais recentemente, Piccirillo e colegas elegantemente mostraram que BMP-4 promove a diferenciação de GSC em astrócitos com anti-GBM significativos efeitos in vitro e in vivo9.
A justificativa para o estudo atual é baseada em uma abordagem de “engenharia invertida” para segmentação GSCs. Dada a vasta heterogeneidade presente em GBM e com pobre diferenciação, sendo uma das marcas registradas do câncer, pedimos que se nós poderia promover um fenótipo mais favorável – diferenciação em um estado de astrocyte. Aqui, não temos conhecimento prévio dos caminhos sinalização que manter GSCs em uma amostra de determinado tumor mas prefiro visam alcançar um fenótipo desejado (por exemplo, positividade GFAP).
Este relatório descreve os procedimentos utilizados para estabelecer o GSC diferenciação repórter-linhas da transdução de culturas GSC-enriquecido a Seleção clonal de GSC. Estabeleceram-se as linhas de neurosphere de glioblastoma usadas no laboratório do Professor Angelo Vescovi de pacientes com diagnóstico de glioblastoma primário no Hospital San Raffaele – Milano, Itália. Estas linhas têm sido muito estudadas em várias publicações 6,10,11,12,13,14. É altamente recomendado que os indivíduos que estão interessados em implementar estas técnicas em seu laboratório determinam a relevância do repórter, a capacidade de auto-renovação de células-tronco de câncer nas células eles planejam estudar (isto é verdadeiro para qualquer repórter). Um protocolo detalhado para um dos ensaios clonogenic em vitro aceitados no campo é fornecido para realizar este15,16. Finalmente, um protocolo detalhado descrevendo a utilização das linhas de repórter de diferenciação em um teste de drogas baseada em citometria de fluxo é fornecido no final. Da nota, da mesma forma para o sistema de diferenciação de Ralevic descrito aqui, nós temos com sucesso estabelecido e validado linhas de repórter GSC integrando um repórter (diferenciação neuronal) de MAP2:GFP. Portanto, as metodologias descrevem neste livro pode ser aplicado para estudar a diferenciação celular em várias linhagens de células.
Algumas das figuras neste relatório podem ser encontradas em uma recente publicação: “Atracurium Besylate e outro agentes de bloqueio neuromuscular promover a diferenciação de Ralevic e empobrecem o glioblastoma as células-tronco18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto a maioria dos estudos anteriores de GSCs centradas-se principalmente os marcadores que os definem, neste estudo decidimos tomar a abordagem inversa. Focamos principalmente em progênies diferenciadas gerados pelo GSCs (por exemplo, células expressando marcadores neuronais e Ralevic). Aqui vamos demonstrar a utilização de uma sistema, que é baseado na expressão humana do promotor-dependente GFAP de GFP de despistagem de drogas baseada em célula alto throughput. Todos os experimentos foram realizados utiliza…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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