Detección sistema para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación celular de células de Glioblastoma de drogas basados en citometría flujo
Summary
Se presenta un protocolo de investigación eficiente para la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación astroglial en células de glioblastoma (GSCs). El ensayo se basa en un reportero de la diferenciación de células madre por el que la expresión de la GFP mejorada (eGFP) es conducida por el promotor humano de GFAP.
Abstract
Glioblastoma (GBM) es el tumor cerebral primario más común y más mortal en los adultos, que causa aproximadamente 14.000 muertes cada año en los Estados Unidos solamente. Mediana de supervivencia tras el diagnóstico es menos de 15 meses con máxima quimioterapia temozolomida, la radiación y la resección quirúrgica. Los retos inherentes en el desarrollo de tratamientos más eficaces de GBM se han convertido en cada vez más evidente e incluyen su invasividad inflexible, su resistencia a los tratamientos estándar, su complejidad genética y molecular adaptabilidad y subpoblaciones de GBM células fenotípicas similares a células normales, en este documento se denomina células de glioblastoma (GSCs). Porque GSCs se necesitan para la progresión y el crecimiento del tumor, terapia basada en la diferenciación representa una modalidad de tratamiento viable para estas neoplasias incurables.
El siguiente protocolo describe una colección de procedimientos para establecer un alto rendimiento de cribado plataforma destinada a la identificación de pequeñas moléculas que promueven la diferenciación astroglial de GSC. En el núcleo del sistema es una proteína ácida fibrilosa glial (GFAP) diferenciación reportero. El protocolo contiene los siguientes procedimientos generales: (1) establecer diferenciación de GSC reportero líneas; (2) pruebas/validación de la pertinencia de la reportera a la capacidad de auto-renovación/clonogenic de GSC; y (3) alta capacidad-citometría de flujo basado en detección de drogas.
La plataforma de proyección proporciona un enfoque sencillo y de bajo costo para identificar pequeñas moléculas que promueven la diferenciación GSCs. Además, la utilización de bibliotecas de medicamentos aprobados por la FDA tiene el potencial para la identificación de agentes que pueda reutilizar más rápidamente. Además, se espera que terapias que promueven la diferenciación de células madre de cáncer funcionan en forma sinergística con las actuales terapias “estándar de atención” que han demostrado para atacar y eliminar las células de cáncer diferenciado principalmente más.
Introduction
Estudios recientes han demostrado que los tumores contienen una pequeña población de células, como las células madre cancerosas (CSCs) o las células iniciadoras del tumor, que son responsables de la progresión tumoral, metástasis y resistencia a la quimio y radio terapias 1, 2. la presencia de células madre del cáncer y su progenie más diferenciado dentro de los tumores se considera importante promover la heterogeneidad intratumoral y representa un obstáculo importante en el tratamiento de cáncer3. Jerarquía de célula tumoral, proporcionado por la teoría de la célula de vástago del cáncer, ha inspirado el desarrollo de nuevas estrategias para tratar el cáncer 4. Un enfoque para apuntar las células de vástago del cáncer es identificar e inhiben vías de señalización que se saben que son necesarios durante el desarrollo embrionario del órgano afectado. De hecho, nosotros y otros hemos publicado anteriormente varios papers describiendo la exigencia permanente de las nervios células relevantes vías de señalización Sonic Hedgehog y muesca en glioblastoma5,6,7. Este trabajo ha ayudado en la justificación de varios ensayos clínicos de GBM de solidificación. Un segundo enfoque para apuntar las células madre cancerosas es promover su diferenciación. Este enfoque ha recibido un gran apoyo debido a los resultados favorables de estudios preclínicos y clínicos en el tratamiento de la leucemia promyelocytic aguda con ácidos retinoico (ATRA, un análogo de la vitamina A). Aquí ATRA fue encontrado para quitar el bloque de maduración y promover el cáncer de la célula diferenciación8. Más recientemente, Piccirillo y colegas han demostrado elegantemente que BMP-4 promueve la diferenciación de GSC en astrocitos con anti-GBM significativos efectos in vitro e in vivo9.
La justificación para el presente estudio se basa en un enfoque de “ingeniería inversa” para apuntar GSCs. Dada la gran heterogeneidad presente en GBM y con pobre diferenciación, siendo una de las características distintivas del cáncer, preguntamos si podíamos promover un fenotipo más favorable – diferenciación en un estado de astrositos. Aquí, no tenemos conocimiento previo de las vías de señalización que mantener GSCs en un espécimen del tumor determinado sino más bien pretenden conseguir un fenotipo deseado (p. ej. positividad GFAP).
Este informe describe los procedimientos utilizados para establecer GSC diferenciación reportero-líneas de la transducción de la culturas enriquecida con GSC para selección clonal de GSC. El glioblastoma desarrolló líneas se establecieron en el laboratorio del Profesor Angelo Vescovi de pacientes con diagnóstico de glioblastoma primario en el Hospital San Raffaele – Milano, Italia. Estas líneas se han estudiado ampliamente en varias publicaciones 6,10,11,12,13,14. Se recomienda que los individuos que están interesados en la aplicación de estas técnicas en su laboratorio determinan la relevancia de la reportera a capacidad de auto-renovación de células madre de cáncer en las células que planean estudiar (esto es cierto para cualquier reportero). Se proporciona un protocolo detallado de uno de los ensayos de clonogenic en vitro aceptados en el campo para llevar a cabo este15,16. Por último, se proporciona un protocolo detallado que describe la utilización de las líneas de reportero de diferenciación en una pantalla de drogas basado en citometría de flujo al final. De nota, igualmente para el sistema de diferenciación astroglial descrito aquí, hemos correctamente establecido y validado líneas de reportero de GSC integración reportero MAP2:GFP (diferenciación neuronal). Por lo tanto, las metodologías se describen en este documento puede aplicarse para estudiar diferenciación celular en varios linajes celulares.
Algunas de las figuras en este informe se pueden encontrar en una publicación reciente: “Atracurium Besylate y otros agentes bloqueadores neuromusculares promover diferenciación astroglial y agotan glioblastoma células madre18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mientras la mayoría de los estudios previos de GSCs centrados principalmente en los marcadores que los definen, en este estudio se decidió adoptar el enfoque inverso. Nos centramos principalmente en las progenies diferenciadas generadas GSCs (p. ej., células expresan marcadores neuronales y astroglial). Aquí se demuestra la utilización de un sistema, que se basa en la expresión humana de promotor dependiente GFAP de GFP de detección de drogas basadas en células de alto rendimiento. Todos los experimentos se reali…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido parcialmente financiado por NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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