Flöde flödescytometri-baserade Drug Screening System för identifiering av små molekyler som främjar celldifferentiering av Glioblastoma stamceller
Summary
En effektiv screening protokoll presenteras för identifiering av små molekyler som främjar astroglial differentiering i glioblastoma stamceller (GSCs). Analysen är baserad på stamcells differentiering reporter varvid uttrycket av den förbättrade GFP (andra) drivs av mänskliga Fredsgenomförande arrangören.
Abstract
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och mest dödliga primär hjärntumör hos vuxna, orsakar ungefär 14 000 dödsfall varje år enbart i USA. Medianöverlevnad efter diagnos är mindre än 15 månader med maximal kirurgisk resektion, strålning och temozolomide kemoterapi. Utmaningarna som utveckla effektivare GBM behandlingar har blivit allt tydligare, och dess orubbliga invasivitet, dess motstånd mot standardbehandlingar, dess genetiska komplexiteten och molekylär anpassningsförmåga och subpopulationer av GBM celler med fenotypiska likheterna med normala stamceller, hädanefter kallas glioblastom stamceller (GSCs). Eftersom GSCs krävs för tumörtillväxt och progression, representerar differentiering-baserad terapi en livskraftig behandling modaliteten för dessa obotlig neoplasmer.
Följande protokoll beskriver en samling av förfaranden för att en hög genomströmning screening plattform syftar till identifiering av små molekyler som främjar GSC astroglial differentiering. Kärnan i systemet är en glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande) differentiering reporter-konstruktion. Protokollet innehåller följande allmänna procedurer: (1) om inrättande av GSC differentiering reporter linjer; (2) testning/validera relevansen av reportern till GSC self-förnyelse/clonogenic kapacitet; och (3) hög kapacitet-flödescytometri baserat drogkontroll.
Screening plattformen ger en enkel och billig metod för att identifiera små molekyler som främjar GSCs differentiering. Dessutom innehar utnyttjande av bibliotek av FDA-godkända läkemedel risken för identifiering av ämnen som kan vara repurposed snabbare. Också, terapier som främjar cancer stamcellers differentiering förväntas arbeta synergistiskt med nuvarande ”standard of care” behandlingar som har visat att identifiera och eliminera primärt mer differentierad cancerceller.
Introduction
Nyligen genomförda studier har visat att tumörer innehåller en liten population av celler, kallas cancerstamceller (CSCs) eller tumör-inleda celler, som är ansvariga för tumör progression, metastaser och motstånd till chemo – och radio-terapier 1, 2. förekomsten av cancerstamceller och deras mer differentierade avkommor inom tumörer anses vara en viktig faktor att främja intratumoral heterogenitet och utgör därmed ett stort hinder i behandling av cancer3. Tumör cell hierarki, som tillhandahålls av cancer stamceller teorin, har inspirerat utvecklingen av nya strategier för att behandla cancer 4. En metod för inriktning cancerstamceller är att identifiera och hämma signalvägar som är kända att krävas under fosterutvecklingen av det drabbade organet. Faktiskt har vi och andra tidigare publicerat flera artiklar som beskriver pågående kravet för de neurala stamceller-relevanta signalvägar Sonic Hedgehog och skåran i glioblastoma5,6,7. Detta arbete har hjälpt stelnar den logiska grunden för flera GBM kliniska prövningar. En andra strategi för inriktning cancerstamceller är att främja deras differentiering. Detta synsätt har fått mycket stöd på grund av de gynnsamma resultat från prekliniska och kliniska studier vid behandling av akut promyeloisk leukemi med retinoinsyra syror (ATRA, en vitamin A-analog). Här hittades ATRA ta bort blocket mognad och främja cancer cell differentiering8. Mer nyligen, Piccirillo och kollegor har elegant visat att BMP-4 främjar GSC differentiering in astrocyter med betydande anti-GBM effekter in vitro- och in-vivo9.
Den logiska grunden för den aktuella studien är baserad på en ”reversed engineering” strategi för att rikta GSCs. Med tanke på den stora heterogeniteten som är närvarande i GBM och med dålig differentiering är ett av kännetecknen för cancer, frågade vi om vi kunde främja en mer gynnsam fenotyp – differentiering in ett Astrocyten-liknande tillstånd. Här, har vi inte tidigare kunskap om de signalvägar som underhåller GSCs i given tumör prov men snarare syftar till att uppnå en önskad fenotyp (e.g. Fredsgenomförande positivitet).
Rapporten beskriver de förfaranden som används för att fastställa GSC differentiering reporter-linjer från transduktion av GSC-berikad kulturer till GSC klonförädling. De glioblastoma neurosphere linjerna används fastställdes vid Professor Angelo Vescovi laboratorium från patienter med diagnosen primär glioblastoma på sjukhuset San Raffaele – Milano, Italien. Dessa linjer har studerats i flera publikationer 6,10,11,12,13,14. Det rekommenderas att individer som är intresserade av att genomföra dessa tekniker i deras laboratorium avgöra relevansen av reportern till cancer stamceller självförnyelse kapacitet i de celler som de planerar att studera (detta är sant för någon reporter). Ett detaljerat protokoll för en av in vitro- clonogenic analyserna accepteras i fältet finns för att åstadkomma detta15,16. Slutligen finns ett detaljerat protokoll som beskriver användningen av differentiering reporter-raderna i en flödescytometri-baserat drog skärm i slutet. Notera, har likaså till astroglial differentiering systemet beskrivs här, vi framgångsrikt etablerat och validerade GSC reporter linjer att integrera en MAP2:GFP (neuronal differentiering) reporter. Därför, metoderna som Beskriv i detta papper kan användas för att studera celldifferentiering i olika cell härstamningar.
Några av siffrorna i denna rapport kan hittas i en ny publikation: ”Atracurium Besylate och andra neuromuskulärt blockerande medel främja astroglial differentiering och bryter ned glioblastoma stamceller18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan de flesta av de tidigare studierna av GSCs inriktades främst på de markörer som definierar dem, i denna studie beslutade vi att ta den omvända strategin. Vi fokuserar främst på de differentierade avkommor som genereras av GSCs (t.ex. celler som uttrycker astroglial och neuronala markörer). Här visar vi ett utnyttjande av en cell-baserad hög genomströmning drug screening system, som bygger på mänskliga Fredsgenomförande arrangören-beroende uttryck för god Jordbrukarsed. Alla experiment utfördes utnyt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har varit delvis stöd av NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
