Akış Sitometresi tabanlı uyuşturucu Glioblastoma kök hücre hücresel farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için eleme sistemi
Summary
Bir verimli tarama Protokolü glioblastoma kök hücreler (GSCs) astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlanması için sunulmaktadır. Tahlil sayede gelişmiş GFP (eGFP) ifade insan GFAP’nin düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir bir kök hücre farklılaşması muhabir temel alır.
Abstract
Glioblastoma (GBM) yaklaşık 14.000 ölümlerin her yıl ABD tek başına neden erişkinlerde en sık görülen ve en ölümcül birincil beyin tümörü olduğunu. Medyan sağkalım tanı takip maksimal cerrahi rezeksiyon, radyasyon ve temozolomide kemoterapi ile 15 aydan daha az oldu. Daha etkili GBM tedaviler geliştirmede içsel sorunları giderek açık olmuştur ve onun inatçı invasiveness, dayanıklılığı, standart tedaviler, genetik karmaşıklığı ve moleküler uyum ve GBM altgrupları şunlardır normal kök hücre, fenotipik benzerlikleri hücrelerle glioblastoma kök hücreler (GSCs) burada anılacaktır. GSCs tümör büyüme ve ilerleme için gerekli olduğundan, farklılaşma tabanlı terapisi bu tedavi edilemez neoplazmlar için uygun tedavi yöntemi temsil eder.
Aşağıdaki iletişim kuralı çeşitli GSC astroglial farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlaması amaçlı platform eleme yüksek üretilen iş kurmak için yordamlar açıklanır. Sistemin özünde gliyal fibrillary asidik protein (GFAP’nin) ayrımında muhabir yapıdır. İletişim kuralı aşağıdaki genel yordamlar vardır: (1) GSC farklılaşma muhabir satırları; kurulması (2) doğrulama sınama?; / muhabir alaka GSC öz-yenileme/klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar kapasitesi ve (3) yüksek kapasiteli Akış Sitometresi uyuşturucu tarama tabanlı.
Tarama platform GSCs farklılaşma teşvik küçük moleküller tanımlamak için basit ve ucuz bir yaklaşım sağlar. Ayrıca, kitaplıkları FDA tarafından onaylanan ilaçların kullanımı daha hızlı güvenilemez ajanların tanımlanması için bir potansiyele sahiptir. Ayrıca, kanser kök hücre farklılaşması teşvik terapiler sinerjik hedef ve öncelikle daha fazla farklı kanser hücrelerinin ortadan kaldırmak için gösterilen geçerli “bakım standart” terapileri ile çalışması öngörülür.
Introduction
Son yıllarda yapılan çalışmalarda tümör küçük bir nüfus içerir göstermiştir kanser kök hücreleri (CSCs) veya tümör başlatılıyor hücreleri, hücrelerinin tümör ilerleme, metastaz ve direnç kemoterapi ve radyo terapi 1, sorumlu olan 2. kanser kök hücreleri ve onların daha farklılaştırılmış ettiklerinizden içinde tümör varlığı intratumoral heterojenlik teşvik önemli bir faktör olarak kabul edilir ve böylece kanser3tedavisinde büyük bir engel temsil eder. Tümör hücre sıradüzeni, kanser kök hücre teorisi tarafından sağlanan kanserleri 4tedavisi için yeni strateji geliştirme ilham kaynağı olmuştur. Kanser kök hücreleri hedefleme için bir yaklaşım tanımlamak ve etkilenen organ embriyonik gelişim sırasında gerekli olduğu bilinmektedir sinyal yolları inhibe etmektir. Nitekim, biz ve diğerleri daha önce birden fazla kağıtları sinirsel kök hücre ile ilgili sinyal yollar Sonic Kirpi ve çentik glioblastoma5,6,7devam eden gereksinimini açıklayan yayımlanmıştır. Bu eser birkaç GBM klinik deneyler için gerekçe güçlendirilerek yardımcı oldu. Kanser kök hücreleri hedefleme için ikinci bir yaklaşım kendi farklılaşma teşvik etmektir. Bu yaklaşım retinoik asit (ATRA, A vitamini analog) ile akut promyelötik lösemi tedavisinde preklinik ve klinik çalışmalar çok olumlu sonuçlar nedeniyle destek aldı. Burada ATRA olgunlaşma blok kaldırmak ve kanser hücre farklılaşması8teşvik bulundu. Daha yakın zamanlarda, Piccirillo ve meslektaşları zarif BMP-4 GSC farklılaşma astrocytes önemli anti-GBM etkileri vitro ve in vivo9içine teşvik göstermiştir.
Çalışmada için gerekçe GSCs hedefleme için “tersine mühendisliği” yaklaşımı temel alır. GBM ve kanser işaretlerinden biri olan zavallı farklılaşma ile mevcut geniş heterojenite göz önüne alındığında, biz daha olumlu bir fenotip – farklılaşma içine bir astrocyte gibi devlet teşvik istedi. Burada, biz önceden bilgi sahibi bir belirli tümör numune GSCs korumak, ancak oldukça istenen fenotip (örneğin GFAP’nin pozitifliği) elde etmek amacı sinyal yolları yok.
Bu rapor GSC farklılaşma muhabir-satırlarından GSC zenginleştirilmiş kültürlerin iletim GSC klonal seçim kurmak için kullanılan yordamları açıklar. Kullanılan glioblastoma neurosphere çizgiler Laboratuvarı Profesör Angelo Vescovi hastaların hastane San Raffaele – Milano, İtalya, birincil glioblastoma tanısı ile kuruldu. Bu satırları çeşitli yayınları 6,10,11,12,13,14‘ te kapsamlı bir şekilde inceledik. Onların laboratuvarda bu teknikleri uygulamak için ilgi duyan bireyler muhabir kanser kök hücre kendini yenileme kapasite çalışmaya planladıkları hücrelerdeki alaka düzeyi belirlemek önerilir (Bu herhangi bir muhabir için geçerlidir). Detaylı bir iletişim kuralı alanında kabul vitro klonojenik progenitör mobilizasyonu yapar deneyleri biri için bu15,16gerçekleştirmek için sağlanmıştır. Son olarak, farklılaşma muhabir satırlarında bir Akış Sitometresi dayalı uyuşturucu testi kullanımını açıklayan ayrıntılı bir protokol vasıl belgili tanımlık son sağlanır. Belirtmek gerekirse benzer şekilde burada, açıklanan astroglial farklılaşma sistemi biz başarıyla kurulan ve bir MAP2:GFP (Nöronal Farklılaşma) muhabiri entegre GSC muhabir satırları doğrulanmış. Bu nedenle, bu yöntemleri tarif kağıt çeşitli hücre soy içine hücresel başkalaşım çalışmaya uygulanan.
Bu rapordaki rakamlar bazıları son yayında bulunabilir: “Atracurium besilat ve diğer nöromüsküler engelleyici ajanlar astroglial farklılaşma teşvik ve glioblastoma kök hücre18tüketmek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Öncelikle onları define işaretleri üzerinde duruldu GSCs önceki çalışmaların en, bu çalışmada geriye doğru yaklaşım almaya karar verdik. Öncelikle GSCs (örneğin, astroglial ve nöronal işaretleri ifade hücreleri) tarafından oluşturulan farklılaştırılmış ettiklerinizden odaklanmak. Burada eleme sistemi, insan GFAP’nin organizatörü bağımlı ifade GFP ve üzerinde temel alan bir hücre tabanlı yüksek üretilen iş ilaç kullanımını göstermektedir. Neurosphere hasta kaynaklı glioblastom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH R01CA187780 tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
- Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
- Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
- Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
- Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
- Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
- Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
- Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
- Warrell, R. P., et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
- Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
- Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
- Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
- Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
- Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
- Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
- Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
- Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).
