Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome
Summary
Un protocole de dépistage efficace est présenté pour l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials dans les cellules souches glioblastome (CSS). L’analyse est basée sur un journaliste de différenciation de cellules souches selon laquelle l’expression de la GFP améliorée (eGFP) est entraînée par le promoteur GFAP humain.
Abstract
Glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale primaire plus meurtrières et les plus courants chez les adultes, causant environ 14 000 décès chaque année aux États-Unis seulement. Durée médiane de survie après le diagnostic est inférieure à 15 mois avec une chimiothérapie témozolomide, rayonnement et résection chirurgicale maximale. Les défis inhérents à développer des traitements plus efficaces de GBM sont devenus de plus en plus clairs et incluent son effraction inflexible, sa résistance aux traitements standard, sa complexité génétique et moléculaire adaptabilité et sous-populations de GBM cellules avec similitudes phénotypiques des cellules souches normales, ci-après désigné comme des cellules souches glioblastome (CSS). Parce que les CSS sont requises pour la progression et la croissance tumorale, la thérapie axée sur la différenciation représente une modalité de traitement viable pour ces tumeurs incurables.
Le protocole suivant décrit une collection de procédures visant à établir un criblage à haute plateforme visant à l’identification de petites molécules qui favorisent la différenciation astroglials GSC. Au cœur du système est une protéine fibrillaire acide gliale (GFAP) différenciation journaliste-construction. Le protocole contient les procédures générales suivantes : (1) établir des lignes de GSC différenciation journaliste ; (2) essais/validation de la pertinence du reporter à la capacité d’auto-renouvellement/clonogéniques GSC ; et (3) haute capacité-cytométrie de dépistage des drogues.
La plateforme de criblage fournit une approche simple et peu coûteuse pour identifier des petites molécules qui favorisent la différenciation des CGV. De plus, l’utilisation des bibliothèques de médicaments approuvés par la FDA détient le potentiel pour l’identification d’agents qui peuvent être réutilisés plus rapidement. Aussi, les thérapies qui favorisent la différenciation des cellules souches du cancer sont censés agissent en synergie avec les traitements actuels de « norme de diligence » qui auraient dû être divulgués afin de cibler et éliminer principalement plus de cellules différenciées du cancer.
Introduction
Des études récentes ont montré que les tumeurs contiennent une petite population de cellules, appelées les cellules souches du cancer (CSC) ou les cellules tumorales qui lance, qui sont responsables de la progression tumorale, métastase et résistance aux traitements chimio – et radio 1, 2. la présence de cellules souches cancéreuses et leurs progénitures plus différenciées au sein de tumeurs est considéré comme un facteur important favorisant l’hétérogénéité intratumorale et représente donc un obstacle majeur dans le traitement de cancers3. Hiérarchie de cellule de tumeur, fournie par la théorie des cellules souches du cancer, a inspiré l’élaboration de nouvelles stratégies pour traiter les cancers 4. Une approche pour cibler les cellules souches cancéreuses consiste à identifier et à inhiber les voies de signalisation qui sont connus pour être requis pendant le développement embryonnaire de l’organe atteint. En effet, nous et autres avons déjà publié plusieurs documents décrivant le besoin continu de cellules souches-pertinentes signalisation voies neurales Sonic Hedgehog et l’encoche dans le glioblastome5,6,7. Ce travail a contribué à solidifier la raison d’être de plusieurs essais cliniques de GBM. Une deuxième approche pour cibler les cellules souches cancéreuses est de promouvoir leur différenciation. Cette approche a reçu beaucoup d’aide en raison des résultats favorables des études précliniques et cliniques dans le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire avec acides rétinoïque (ATRA, un analogue de la vitamine A). Ici ATRA a été trouvé pour retirer le bloc de maturation et favoriser le cancer de la différenciation cellulaire8. Plus récemment, Piccirillo et ses collègues ont démontré avec élégance que BMP-4 favorise la différenciation GSC dans les astrocytes avec anti-MBG importants effets in vitro et in vivo9.
La justification de cette étude est basée sur une approche de « l’ingénierie inversée » afin de cibler les CGV. Compte tenu de la grande hétérogénéité présente dans GBM et avec mauvaise différenciation étant l’une des principales caractéristiques du cancer, nous avons demandé si nous pourrions promouvoir un phénotype plus favorable – différenciation dans un état semblable au astrocyte. Ici, nous n’avons pas de connaissance préalable des voies de signalisation qui maintiennent des CSS dans un échantillon donné de tumeur mais plutôt pour objectif d’obtenir un phénotype souhaité (par exemple les positivité GFAP).
Ce rapport décrit les procédures utilisées pour établir la GSC différenciation journaliste-lignes de la transduction des cultures GSC-enrichi à la sélection clonale de GSC. Les glioblastome Neurosphère lignes utilisées ont été créés au laboratoire du professeur Angelo Vescovi provenant de patients avec un diagnostic de glioblastome primaire à l’hôpital San Raffaele – Milano, Italie. Ces lignes ont été largement étudiées dans plusieurs publications 6,10,11,12,13,14. Il est fortement recommandé que les personnes qui s’intéressent à la mise en œuvre de ces techniques dans leur laboratoire juger de la pertinence du reporter à capacité d’auto-renouvellement de cellules souches du cancer dans les cellules qu’ils envisagent d’étudier (Ceci est vrai pour n’importe quel journaliste). Un protocole détaillé pour l’un des essais clonogéniques in vitro acceptés dans le domaine est fourni pour accomplir ce15,16. Enfin, un protocole détaillé décrivant l’utilisation des lignes journaliste différenciation dans un dépistage de drogues de cytométrie en flux-basée est fourni à la fin. De note, de même pour le système de différenciation astroglials décrit ici, nous avons avec succès établi et validé des lignes de journaliste de GSC intégrant un journaliste (différenciation neuronale) de MAP2:GFP. Par conséquent, les méthodologies de décrivent dans ce papier peut être appliquée à l’étude de la différenciation cellulaire dans diverses lignées cellulaires.
Certains chiffres dans ce rapport se trouve dans une publication récente : « bésylate d’Atracurium et autres agents bloquants neuromusculaires promouvoir la différenciation astroglials et appauvrissent glioblastoma cellules souches18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alors que la plupart des études précédentes de CSS portés principalement sur les marqueurs qui définissent leur, dans cette étude, nous avons décidé d’adopter l’approche inverse. Nous nous concentrons principalement sur les descendances différenciées générés par CSS (par exemple, les cellules exprimant astroglials et marqueurs neurones). Nous démontrons l’utilisation d’un médicament à haut débit basés sur les cellules contrôle système, qui repose sur l’expression humaine GFAP promoteur dépe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement prises en charge par le NIH R01CA187780.
Materials
| ESGRO Complete Accutase | EMD Millipore | SF006 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Sigma Aldrich | H6648 | |
| Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo, Virus) | SBI (System Biosciences) | SR10015VA-1 | |
| 50 ml sterile disposable reagent reservoirs | Corning | 4870 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 96 well plate | Falcon | 353072 | |
| Biolite T25 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130189 | |
| Biolite T75 cm² Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130190 | |
| 15 ml Centrifuge tubes | Celltreat | 229411 | |
| 1.5ml Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 0.5 – 20uL | VistaLab Technologies | 1060-0020 | |
| Ovation Multi Channel Pipette, 12 Channel, 5-250uL | VistaLab Technologies | 1060-0250 | |
| Multi 12-channel pipette tips 25 μl | VistaLab Technologies | 4060-1002 | |
| Multi 12-channel pipette tips 250 μl | VistaLab Technologies | 4060-9025 | |
| Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cytometer | EMD Millipore | 0500-4005 | |
| NIH Clinical Collections 1 and 2 small molecule libraries | Evotec | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For the preparation of neural stem cell media (500 mL) | Final concentration | ||
| BSA | GoldBio.com | A-421-250 | 0.20% |
| DMEM/F12 10X | Corning | 90-091-PB | 1X |
| Heparin sodium salt | Sigma Aldrich | H3149 | 0.0002% |
| HEPES 1M | Sigma Aldrich | H4036 | 5.4 mM |
| Insulin-Transferrin- Selenium (ITS -G) (100X) | Life Technologies | 41400-045 | 1X |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S-5761 | 14.5 mM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) 100X | Gibco | 15140-122 | 1X |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | 16 nM |
| Putrescine | Sigma Aldrich | P5780 | 4.8 µM |
| Basic FGF (FGF2), Human | GoldBio | 1140-02-50 | 10 ng/ml |
| EGF, Human | GoldBio | 1150-04-100 | 20 ng/ml |
| Bottle-Top Filter, 150ml, 33mm, 0.22um, Pes, S, Ind | Corning | 431160 | Use to filter sterlize media |
References
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