Toepassing van MultiColor FlpOut techniek om hoge resolutie eencellige Morphologies en cel interacties van Glia in Drosophila te studeren
Summary
Cellen weergeven van verschillende morphologies en stellen een verscheidenheid van interacties met hun buren. Dit protocol wordt beschreven hoe te onthullen van de morfologie van afzonderlijke cellen en cel-cel interactie onderzoeken met behulp van de gevestigde Gal4/UAS expressie systeem.
Abstract
Verschillende morphologies en complexe anatomische relaties worden weergegeven in cellen. Hoe de cellen communiceren met hun buren? Verschillen de interacties tussen celtypes of zelfs binnen een bepaald type? Wat voor soort ruimtelijk regels volgt ze? De antwoorden op deze fundamentele vragen in vivo hebben tot nu toe belemmerd door een gebrek aan hulpmiddelen voor het labelen van hoge resolutie eencellige. Hier vindt u een gedetailleerd protocol te richten op enkele cellen met een MultiColor FlpOut (MCFO) techniek. Deze methode is gebaseerd op drie anders tagged verslaggevers (HA, vlag en V5) onder UAS controle die stille worden gehouden door een transcriptionele terminator geflankeerd door twee FRT sites (FRT-stop-FRT). Een warmte-puls induceert de uitdrukking van een warmte schok-geïnduceerde Flp recombinase, die willekeurig de FRT-stop-FRT cassettes in afzonderlijke cellen verwijdert: expressie treedt alleen op in cellen die ook uitdrukking geven aan een GAL4 stuurprogramma. Dit leidt tot een matrix van verschillend gekleurde cellen van een bepaald celtype waarmee de visualisatie van individuele cel morphologies met hoge resolutie. Als voorbeeld, kan de MCFO-techniek worden gecombineerd met specifieke gliale GAL4-stuurprogramma’s te visualiseren van de morphologies van de verschillende gliale subtypen van in de volwassen Drosophila hersenen.
Introduction
Glia, de bevolking van de non-neuronale cellen van het zenuwstelsel (NS), lang werden verondersteld een statische kader te bieden voor neuronen en daarom niet in detail zijn bestudeerd. Echter bij de mens, glia vormen de overgrote meerderheid van de cellen in de NS (~ 90%) en vallen in verschillende categorieën, met inbegrip van astrocyten, oligodendrocyten, microglia en cellen van Schwann. Glia vormen in Drosophila, ongeveer 10% van de cellen in de NS. Intrigerend, zijn hun morphologies en functies opvallend vergelijkbaar met die gevonden in gewervelde dieren1,2. Hun morphologies omvatten de bloed – hersen barrière (BBB) vormen epitheel, ensheathing en Astrocyt-achtige cellen.
De Drosophila centrale zenuwstelsel (CNS) bestaat uit de volgende belangrijkste structuren: cortex-regio’s waarin de neuronale cel organen; neuropils die synaptic verbindingen haven; kleine en grote axon traktaten die verbinding maken met de verschillende neuropiles; perifere zenuwen die zintuiglijke organen en spieren met het CNS (Figuur 1 verbinden). Glia zijn gevonden die zijn gekoppeld aan alle van deze anatomische structuren: Cortex glia (CG) in de corticale gebieden, Astrocyt-achtige glia (ALG) en ensheathing glia (EG) in de neuropile regio’s, ensheathing glia houden ook verband met centrale axon vezelbundels en perifere zenuwen (EGN), en ten slotte twee blad-achtige glia, perineurial glia (PG) en subperineurial (SPG), die vormen samen een aaneengesloten laag dat betrekking heeft op de hele NS (Figuur 2).
Eerdere studies hebben aangetoond dat glia spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling van de NS; Zij bewaken van neuronale cel nummers door te reageren op insuline-achtige peptiden systemisch te circuleren, neuronen, zoals de Astrocyt-neuron lactaat shuttle, trofische ondersteunen en elimineren van stervende neuronen door fagocytose3,4 , 5 , 6. in de volwassen NS, glia behouden van de BBB, neurotransmitters innemen en handhaven van Ionische homeostase, fungeren als de grote immuuncellen in de NS, aangezien de macrofagen kunnen schenden de BBB en moduleren synaptic activiteit evenals dierlijk gedrag6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Of gespecialiseerde functies worden uitgevoerd in de verschillende gliale subtypen blijft een belangrijk open vraag. Een systematische analyse van het genoom-brede van glia, vooral in de volwassen, heeft echter belemmerd door een gebrek aan passende genetische hulpmiddelen voor hun manipulatie. Hier, wordt een methode waarmee de karakterisering van het efficiënt en eenvoudig cel vormen om te studeren van complexe cel-cel interactie gepresenteerd. Deze techniek is vereffend karakteriseren de morfologie van de verschillende gliale subtypes in de volwassen hersenen Drosophila , maar, afhankelijk van de specifieke GAL4 stuurprogramma gebruikt, het zou kunnen worden aangepast om te bestuderen van neuronen12,13 , elke vorm van vermenging cellen, en in principe elk weefsel in elke ontwikkelingsstadia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en efficiënte methode om te studeren van de morfologie van de verschillende soorten cellen binnen een weefsel van belang op hoge resolutie. Met de MCFO techniek, worden meerdere verslaggevers met verschillende epitoop tags gebruikt in combinatie voor multicolor stochastische labeling (Figuur 2). Vergelijkbaar met andere methoden zoals zwHANSje/Flybow15,16,17…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Arnim Jenett Aljoscha Nern en andere leden van de Rubin laboratorium voor advies en delen van ongepubliceerde reagentia en het Janelia vliegen licht projectteam voor confocal afbeeldingen te genereren. De auteurs dank ook de leden van het laboratorium van Gallië voor opmerkingen op het manuscript.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
