יישום טכניקת FlpOut ססגוניות ללמוד ברזולוציה גבוהה תא בודד מורפולוגיות ו תא אינטראקציות של עכשיו, דונלד ב דרוזופילה
Summary
התאים להציג מורפולוגיות שונות, ליצור מגוון רחב של אינטראקציות עם שכניהם. פרוטוקול זה מתאר איך לחשוף את המורפולוגיה של תאים בודדים כדי לחקור את תא-תא אינטראקציה באמצעות מערכת ביטוי Gal4/UAS ומבוססת.
Abstract
תאים להציג מורפולוגיות שונות ויחסים האנטומי מורכב. כיצד תאים אינטראקציה עם שכניהם? האינטראקציות נבדלים בין סוגי תאים או אפילו בתוך סוג מסוים? אילו סוגים של חוקים מרחבי הם בצע? תשובות כאלה שאלות עקרוניות ויוו יש כבר הקשו עד כה על ידי חוסר כלים עבור תיוג תא בודד ברזולוציה גבוהה. . הנה, פרוטוקול מפורט היעד תאים בודדים עם טכניקה ססגוניות FlpOut (MCFO) הינו מסופק. שיטה זו מתבססת על שלושה אחרת מתויג עיתונאים (HA, דגל ו- V5) תחת שליטה UAS שנשמרים שקט מאת בסיים תעתיק ולצדו והשפלתם שני אתרים (והשפלתם-עצור-והשפלתם). דופק הלם החום המניע את הביטוי חום הנוצרות על-ידי הלם Flp recombinase, אשר באופן אקראי מסירה את הקלטות והשפלתם-עצור-והשפלתם תאים בודדים: ביטוי מתרחשת רק בתאים המבטאים גם מנהל התקן GAL4. זה מוביל מערך של תאים בצבעים שונים של סוג תא נתון המאפשר את החזיית תא בודד מורפולוגיות ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, הטכניקה MCFO יכול להיות משולב עם נהגים GAL4 גליה ספציפיים כדי להמחיש את מורפולוגיות מסוגי המשנה גליה שונים במוח דרוזופילה למבוגרים.
Introduction
עכשיו, דונלד, האוכלוסייה הלא-דופאמינרגיים של מערכת העצבים (NS), זמן האמינו לספק מסגרת סטטי של נוירונים, לכן לא נחקרו בפירוט. עם זאת, אצל בני אדם, עכשיו, דונלד מהווים את הרוב המכריע של תאים שריכזה (~ 90%), מחולקים למספר קטגוריות שונות, כולל האסטרוציטים, oligodendrocytes להפוך, מיקרוגלייה תאי שוואן. דרוזופילה, עכשיו, דונלד מהווים כ- 10% של תאים שריכזה. מסקרן, מורפולוגיות והפונקציות שלהם דומים להפליא אלה שנמצאו בעלי חוליות1,2. מורפולוגיות שלהם כוללים את מחסום הדם – מוח (BBB) ויוצרים epithelia, ensheathing ותאים אסטרוציט דמוי.
מערכת העצבים המרכזית (CNS) דרוזופילה מורכב המבנים העיקריים הבאים: קליפת אזורים המכילים את הגופות תאים עצביים; neuropils זה הנמל קשרים סינפטיים; ספינלי האקסון קטנים וגדולים המחברים את neuropiles שונים; העצבים ההיקפיים המחוברים אברי החישה והשרירים עם מערכת העצבים (איור 1). עכשיו, דונלד נמצאים המשויכים כל מבנים אנטומיים אלה: קליפת עכשיו, דונלד (CG) באזורים קורטיקליים, אסטרוציט כמו עכשיו, דונלד (נועה) ו- ensheathing עכשיו, דונלד (למשל) באזורים neuropile, ensheathing עכשיו, דונלד קשורים גם עם ספינלי האקסון המרכזית, ההיקפית העצבים (EGN), ולבסוף, שני גיליון עכשיו, דונלד, עכשיו, דונלד perineurial (עמוד) subperineurial (SPG), אשר ביחד יוצרים שכבה רציפה שמכסה את NS כולו (איור 2).
מחקרים קודמים הראו כי עכשיו, דונלד תפקיד חשוב בהתפתחות NS; הם לפקח דופאמינרגיים מספרים על ידי מגיב מערכתית במחזור דמוי אינסולין הפפטידים, לספק תמיכה עם מחלות את הנוירונים, כגון המעבורת לקטט אסטרוציט-נוירון, ולחסל נוירונים גוססים על ידי phagocytosis3,4 , 5 , 6. שריכזה בוגרת, עכשיו, דונלד לשמור על BBB, תופסים נוירוטרנסמיטורים לשמור על הומאוסטזיס יוניים, לשמש התאים החיסוניים הגדולות המחלקה שכן המקרופאגים לא יכול לפרוץ BBB, לווסת את פעילות סינפטית, כמו גם התנהגות בעלי חיים6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
אם תתי סוגים שונים גליה לבצע פונקציות מיוחדות נותרת שאלה פתוחה חשוב. עם זאת, ניתוח הגנום כולו שיטתית של עכשיו, דונלד, במיוחד אצל אדם בוגר, יש כבר הקשו על ידי חוסר המתאימה לכלים שלהם מניפולציה גנטית. כאן, מוצגת שיטה המאפשרת אפיון תא צורות ללמוד אינטראקציות מורכבות תא תא יעיל וקל. טכניקה זו הוחל לאפיין המורפולוגיה של גליה תתי-סוגים שונים במוח דרוזופילה למבוגרים, אבל, בהתאם הנהג GAL4 ספציפי בשימוש, זה יכול להיות מותאם ללמוד נוירונים12,13 , כל סוג של תאים בזה, באופן עקרוני כל רקמות בשלבים התפתחותיים כלשהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה נוחה ויעילה ללמוד המורפולוגיה של סוגי תאים שונים בתוך רקמה עניין ברזולוציה גבוהה. עם הטכניקה MCFO, כתבים מרובים עם תגי epitope שונים משמשים בשילוב של תיוג סטוכסטי ססגוניות (איור 2). בדומה בשיטות אחרות כגון Brainbow/Flybow15,16,<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה ארנים Jenett Aljoscha Nern, חברים אחרים של המעבדה רובין לקבלת ייעוץ ושיתוף של ריאגנטים שלא פורסמו, Janelia לטוס אור צוות הפרוייקט ליצירת תמונות קונפוקלי. המחברים גם תודה חברי המעבדה גאליה להערות על כתב היד.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
