Drosophila में Glia के उच्च संकल्प एकल कोशिका Morphologies और सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए बहुरंगा FlpOut तकनीक का अनुप्रयोग
Summary
कोशिकाओं को अलग morphologies प्रदर्शन और अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत की एक किस्म की स्थापना । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि कैसे एकल कक्षों की आकृति विज्ञान प्रकट करने के लिए और अच्छी तरह से स्थापित Gal4/यूएएस अभिव्यक्ति सिस्टम का उपयोग करके कक्ष-कक्ष सहभागिता की जांच करने के लिए ।
Abstract
कक्ष भिंन morphologies और जटिल संरचनात्मक संबंध प्रदर्शित करते हैं । कैसे कोशिकाओं को अपने पड़ोसियों के साथ बातचीत करते हैं? क्या इंटरैक्शन कक्ष प्रकारों के बीच या किसी दिए गए प्रकार में भी अलग होते हैं? वे किस प्रकार के स्थानिक नियमों का पालन करते हैं? vivo में ऐसे फंडामेंटल सवालों के जवाब अब तक हाई रेजोल्यूशन सिंगल सेल लेबलिंग के लिए उपकरणों की कमी से बाधा बने हुए हैं । यहां, एक बहुरंगा FlpOut (MCFO) तकनीक के साथ एकल कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है । इस विधि तीन अलग टैग रिपोर्टर पर निर्भर करता है (हा, झंडा और V5) यूएएस नियंत्रण है कि एक transcriptional टर्मिनेटर दो FRT साइटों (FRT-stop-FRT) द्वारा पार्श्व द्वारा मौन रखा जाता है के तहत । एक गर्मी सदमे पल्स एक गर्मी सदमे प्रेरित Flp recombinase की अभिव्यक्ति लाती है, जो बेतरतीब ढंग से FRT-स्टॉप-FRT कैसेटों को व्यक्तिगत कक्षों में निकालता है: अभिव्यक्ति केवल उन कक्षों में होती है जो किसी GAL4 ड्राइवर को भी व्यक्त करते हैं. यह किसी दिए गए कक्ष प्रकार के भिंन रंग के कक्षों की सरणी की ओर जाता है जो उच्च रिज़ॉल्यूशन पर व्यक्तिगत कक्ष morphologies के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में, MCFO तकनीक विशिष्ट glial GAL4 चालकों के साथ जोड़ा जा सकता है वयस्क glial मस्तिष्क में विभिंन Drosophila उपप्रकार के morphologies कल्पना ।
Introduction
Glia, गैर न्यूरॉन्स तंत्रिका तंत्र के सेल जनसंख्या (एन एस), लंबे समय के लिए न्यूरॉन्स के लिए एक स्थिर ढांचा प्रदान करने के लिए माना जाता था और इसलिए विस्तार से अध्ययन नहीं किया गया. हालांकि, मनुष्यों में, glia एन एस में कोशिकाओं के विशाल बहुमत का गठन (~ ९०%) और astrocytes, oligodendrocytes, microglia और Schwann कोशिकाओं सहित कई विभिन्न श्रेणियों में गिर जाते हैं । Drosophilaमें, glia के बारे में 10% की एन एस में कोशिकाओं का गठन । साज़िश, उनके morphologies और कार्य उल्लेखनीय रीढ़1,2में पाया उन लोगों के समान हैं । उनके morphologies रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) बनाने epithelia, ensheathing, और astrocyte की तरह कोशिकाओं में शामिल हैं ।
Drosophila केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) निंनलिखित प्रमुख संरचनाओं के होते हैं: प्रांतस्था क्षेत्रों है कि न्यूरॉन कोशिका निकायों में शामिल; neuropils कि हार्बर synaptic कनेक्शन; छोटे और बड़े axon पथ जो विभिन्न neuropiles को जोड़ते हैं; परिधीय नसों कि सीएनएस के साथ संवेदी अंगों और मांसपेशियों को जोड़ने (चित्रा 1). Glia इन सभी संरचनात्मक संरचनाओं के साथ जुड़े पाए जाते हैं: cortical क्षेत्रों में प्रांतस्था Glia (सीजी), astrocyte जैसे Glia (ALG) और ensheathing Glia (जैसे) neuropile क्षेत्रों में ensheathing Glia भी केंद्रीय axon इलाकों और परिधीय के साथ जुड़े हुए हैं नसों (EGN), और अंत में, दो शीट की तरह glia, perineurial glia (स्नातकोत्तर) और subperineurial (एसपीजी) है, जो एक साथ एक निरंतर परत है कि पूरे एन एस (चित्रा 2कवर) के रूप में ।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि glia एन एस के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं; वे इंसुलिन की तरह पेप्टाइड्स घूम प्रणालीबद्ध करने के लिए प्रतिक्रिया द्वारा न्यूरॉन सेल संख्या की निगरानी, न्यूरॉन्स के लिए पौष्टिकता समर्थन प्रदान करते हैं, इस तरह के astrocyte के रूप में न्यूरॉन्स स्तनपान शटल, और phagocytosis द्वारा मरने न्यूरॉन्स को खत्म3,4 , 5 , 6. परिपक्व एन एस में, glia BBB बनाए रखने, न्यूरोट्रांसमीटर लेने और ईओण homeostasis, एनएस में प्रमुख प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में कार्य को बनाए रखने के बाद से मैक्रोफेज BBB भंग नहीं कर सकते, और synaptic गतिविधि और साथ ही पशु व्यवहार मॉडुलन6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
क्या विभिंन glial उपप्रकार विशेष कार्य प्रदर्शन एक महत्वपूर्ण खुला सवाल रहता है । हालांकि, glia के एक व्यवस्थित जीनोम व्यापक विश्लेषण, विशेष रूप से वयस्क में, उनके हेरफेर के लिए उपयुक्त आनुवंशिक उपकरणों की कमी से प्रभावित किया गया है । यहां, एक विधि है कि सेल आकार के कुशल और आसान लक्षण वर्णन करने के लिए जटिल सेल सेल बातचीत अध्ययन प्रस्तुत किया है की अनुमति देता है । इस तकनीक को वयस्क Drosophila मस्तिष्क में विभिंन glial उपप्रकार की आकृति विज्ञान की विशेषता के लिए लागू किया गया है, लेकिन, विशिष्ट GAL4 चालक के आधार पर इस्तेमाल किया, यह अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ंयूरॉंस12,13 , मिश्रित कोशिकाओं के किसी भी प्रकार, और सिद्धांत किसी भी विकास के चरणों में किसी भी ऊतक.
Protocol
1. बहुरंगा के लिए मक्खियों की तैयारी FlpOut (MCFO) उपाययोजना
नोट: MCFO तकनीक तथाकथित Flp के एक संशोधित संस्करण को संदर्भित करता है-मध्यस्थता रोक कैसेट उत्पाद (FlpOut) । ट्रांसजेनिक MCFO मक्खियों एक गर्मी सदमे …
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल उच्च संकल्प में ब्याज की एक ऊतक के भीतर विभिन्न कोशिका प्रकार की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक आसान और कुशल विधि का वर्णन. MCFO तकनीक के साथ, विभिंन epitope टैग के साथ कई पत्रकारों बहुरंगा s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक Arnim Jenett, Aljoscha Nern, और सलाह के लिए रुबिना प्रयोगशाला के अंय सदस्यों और अप्रकाशित पुनर्अभिकर्ताओं के बंटवारे और Janelia फोकल छवियों को पैदा करने के लिए प्रकाश परियोजना टीम मक्खी धंयवाद । लेखकों ने पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए गॉल लेबोरेटरी के सदस्यों का भी धन्यवाद किया ।
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
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