Anvendelse av flerfarget FlpOut teknikk høyoppløselig enkeltcelle Morphologies og celle interaksjoner av Glia i Drosophila
Summary
Celler vise forskjellige morphologies og etablere en rekke interaksjon med sine naboer. Denne protokollen beskriver hvordan å avdekke morfologi av enkeltceller og undersøke celle-celle samhandling ved hjelp av veletablerte Gal4/UAS uttrykk system.
Abstract
Cellene viser forskjellige morphologies og komplekse anatomiske relasjoner. Hvordan samhandler celler med sine naboer? Skiller samspillet mellom celletyper eller selv innenfor en gitt type? Hva slags romlige reglene følger de? Svar på slike grunnleggende spørsmål i vivo blitt hemmet så langt av en mangel på verktøy for høy oppløsning enkeltcelle merking. Her tilbys en detaljert protokoll målrette enkeltceller med en flerfarget FlpOut (MCFO)-teknikk. Denne metoden er avhengig av tre annerledes merket journalister (HA, flagg og V5) under UAS kontroll som er holdt stille av en transcriptional terminator flankert av to FRT områder (FRT-stopp-FRT). En varme sjokk puls induserer uttrykk for en varme sjokk-indusert Flp recombinase, som tilfeldig fjerner FRT-stopp-FRT kassettene i enkeltceller: uttrykket forekommer bare i celler som uttrykker også en GAL4 driver. Dette fører til en rekke forskjellig fargede celler for en gitt celle type som tillater visualisering av enkeltcelle morphologies med høy oppløsning. Som et eksempel, kan MCFO teknikken kombineres med glial GAL4 driverne å visualisere morphologies av forskjellige glial undertypene i voksen Drosophila hjernen.
Introduction
Glia, ikke-neuronal celle befolkningen av nervesystemet (NS), ble lenge trodd å gi en statisk ramme for neurons, og derfor var ikke studert i detalj. Men hos mennesker, glia utgjør majoriteten av celler i NS (~ 90%) og faller inn i flere forskjellige kategorier, inkludert astrocyttene, oligodendrocytes, microglia og Schwann celler. I Drosophila, glia utgjør ca 10% av cellene i NS. Intriguingly, er deres morphologies og funksjoner bemerkelsesverdig lik i virveldyr1,2. Deres morphologies inkluderer blod – hjerne barrieren (BBB) epithelia, ensheathing og astrocytter-lignende celler.
Drosophila sentralnervesystemet (CNS) består av følgende viktigste strukturer: cortex regioner som inneholder neuronal cellen legemer. neuropils som havn synaptic tilkoblinger. små og store axon traktater som kobler forskjellige neuropiles; eksterne nerver som kobler Sanseorganer og muskler med CNS (figur 1). Glia finnes forbundet med alle disse anatomiske strukturer: Cortex glia (CG) i kortikale områder, astrocytter-lignende glia (ALG) og ensheathing glia (EG) i neuropile områder, ensheathing glia er også forbundet med sentrale axon traktater og ytre nerver (endelige Medlemskapet), og til slutt, to som glia, perineurial glia (PG) og subperineurial (SPG), som sammen danner en sammenhengende lag som dekker hele NS (figur 2).
Tidligere studier har vist at glia spille en viktig rolle i utviklingen av NS; de overvåke neuronal cellen tallene som reagerer på systemisk sirkulerende insulin-lignende peptider, gir trophic støtte til neurons, som astrocytter-Nevron laktat shuttle, og eliminere døende neurons av fagocytose3,4 , 5 , 6. i eldre NS, glia opprettholde BBB, ta opp nevrotransmittere og opprettholde ioniske homeostase, fungere som de store immunceller i NS, siden makrofager ikke kan bryte BBB og modulere synaptic aktivitet samt dyr opptreden6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Om forskjellige glial subtyper utfører spesialiserte funksjoner er fortsatt et viktig åpent spørsmål. Men vært en systematisk genomet-omfattende analyse av glia, spesielt i voksen, hemmet av mangel på passende genetisk verktøy for sin håndtering. Her vises en metode som gir effektiv og enkel karakterisering av cellen figurer å studere komplekse celle-celle interaksjoner. Denne teknikken er brukt for å karakterisere morfologi av ulike glial subtyper i voksen Drosophila hjernen, men, avhengig av spesifikke GAL4 driveren brukes, det kan tilpasses for å studere neurons12,13 , en slags blanding celler, og i prinsippet alle vev i noen utviklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for å studere morfologi av forskjellige celletyper innenfor en vev rundt med høy oppløsning. Med MCFO teknikk brukes flere journalister med forskjellige epitope koder i kombinasjon for multicolor Stokastisk merking (figur 2). Ligner andre metoder som Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO øker etiketten mangfoldet gjennom markør coexpression, slik …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Arnim Jenett, Aljoscha Nern og andre medlemmer av Rubin laboratorium for råd og deling av upubliserte reagenser og Janelia Fly lys prosjektgruppen for generering av AC confocal bilder. Forfatterne takker også medlemmer av Gallia laboratorium for kommentarer på manuskriptet.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
