Tillämpningen av MultiColor FlpOut teknik att studera högupplösta enda Cell morfologier och Cell interaktioner av Glia i Drosophila
Summary
Celler Visa olika morfologier och upprätta en mängd interaktioner med sina grannar. Det här protokollet beskriver hur att avslöja morfologi av enstaka celler och utreda cell-cell interaktioner med hjälp av väletablerade Gal4/UAS uttryck systemet.
Abstract
Celler visar olika morfologier och komplexa anatomiska förhållanden. Hur samspelar celler med sina grannar? Skiljer samspelet mellan celltyper eller även inom en given typ? Vilka typer av rumsliga regler följer de? Svaren på sådana grundläggande frågor i vivo har hämmats hittills av en brist på verktyg för hög upplösning enskild cell märkning. Här finns ett detaljerat protokoll att rikta enstaka celler med en MultiColor FlpOut (MCFO)-teknik. Denna metod bygger på tre olika märkta reportrar (HA, flagga och V5) under UAS kontroll som är teg av en transkriptionell terminator flankerad av två FRT platser (FRT-stopp-FRT). En värme chock puls inducerar uttryck av en värme chock-inducerad Flp recombinase, som slumpmässigt tar bort FRT-stopp-FRT kassetter i enskilda celler: uttryck förekommer endast i celler som uttrycker också en GAL4 drivrutin. Detta leder till en mängd olikfärgade cellerna i en viss celltyp som möjliggör visualisering av enskild cell morfologier med hög upplösning. Som ett exempel, kan den MCFO tekniken kombineras med specifika gliaceller GAL4 drivrutiner att visualisera morfologier de gliaceller subtyperna i den vuxna hjärnan Drosophila .
Introduction
Glia, icke-neuronala cell befolkningen i nervsystemet (NS), tros länge ge en statisk ram för nervceller och därför studerades inte i detalj. Men hos människor, glia utgör den stora majoriteten av celler i NS (~ 90%) och delas in i flera olika kategorier, inklusive astrocyter, oligodendrocyter, mikroglia och Schwann celler. I Drosophila, glia utgör ca 10% av cellerna i NS. Fängslande, är deras morfologier och funktioner anmärkningsvärt liknande de som finns i ryggradsdjur1,2. Deras morfologier inkluderar blod – hjärnbarriären (BBB) bildar epitel, ensheathing och Astrocyten-liknande celler.
Drosophila centrala nervsystemet (CNS) består av följande huvudsakliga strukturer: cortex regioner som innehåller de neuronala cell organ; neuropils som hamnen synapsförbindelser; små och stora axon skrifter som ansluter den olika neuropiles; perifera nerver som förbinder sensoriska organ och muskler med CNS (figur 1). Glia finns associerade med alla dessa anatomiska strukturer: Cortex glia (CG) i kortikala regionerna, astrocyt-liknande glia (ALG) och ensheathing glia (t.ex.) i neuropile regioner, ensheathing glia är också associerade med centrala axon skrifter och perifera nerver (EGN), och slutligen två blad-liknande glia, perineurial glia (PG) och subperineurial (SPG), som tillsammans bildar ett sammanhängande lager som täcker hela NS (figur 2).
Tidigare studier har visat att glia spelar viktiga roller i utvecklingen av NS; de övervaka neuronala cell nummer genom att reagera på systemiskt cirkulerande insulin-liknande peptider, ge trofiska stöd till nervceller, såsom Astrocyten-neuron laktat shuttle, och eliminera döende nervceller genom fagocytos3,4 , 5 , 6. i mogen NS, glia behålla BBB, ta upp signalsubstanser och upprätthålla Joniska homeostas, fungera som stora immuncellerna i NS, eftersom makrofager inte kan bryter mot BBB, och modulera synaptisk aktivitet samt djurs beteende6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Huruvida de gliaceller subtyperna utföra specialiserade funktioner förblir en viktig öppen fråga. Dock har en systematisk genome-wide analys av glia, särskilt i vuxen, hämmats av brist på lämpliga genetiska verktyg för deras manipulation. Här presenteras en metod som möjliggör en effektiv och enkel karakterisering av cell-former för att studera komplexa cell-cell interaktioner. Denna teknik har tillämpats för att karakterisera morfologi av olika gliaceller undertyper i den vuxna hjärnan Drosophila , men, beroende på den specifika GAL4 drivrutin som används, kan det anpassas för att studera nervceller12,13 , någon form av blandning celler, och i princip alla vävnader i alla utvecklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet beskriver en enkel och effektiv metod för att studera morfologi av olika celltyper i en vävnad av intresse med hög upplösning. Med MCFO teknik används flera reportrar med olika epitop Taggar i kombination för multicolor stokastiska märkning (figur 2). Liknar andra metoder såsom Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO ökar etikett mångfalden genom markör coexpression, möjliggö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Arnim Jenett, Aljoscha Nern och andra medlemmar av Rubin laboratoriet för rådgivning och utbyte av opublicerade reagenser och Janelia flyga ljus projektgruppen för att generera confocal bilder. Författarna också tacka medlemmarna i Gallien laboratoriet för synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. Glia in Drosophila behavior. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
