Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre
Summary
Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.
Abstract
L’analyse des modifications de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier les nouvelles voies qui sous-tendent les phénotypes observés. Le poisson-zèbre est un excellent modèle pour une évaluation rapide du transcriptome entier de populations cellulaires de tout animal ou individuels en raison de la facilité d’isolement de l’ARN du grand nombre d’animaux. Un protocole pour l’analyse de l’expression génique global chez les embryons de poisson-zèbre RNA séquençage (RNASeq) est présenté ici. Nous décrivons la préparation de l’ARN d’embryons entiers ou de populations de cellules obtenues à l’aide de cellules tri chez les animaux transgéniques. Nous décrivons également une approche pour l’analyse des données RNASeq pour identifier les voies enrichis et termes de Gene Ontology (aller) dans les ensembles de données d’expression génique global. Enfin, nous fournissons un protocole pour la validation des modifications de l’expression génique à l’aide de la transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles peuvent être utilisés pour une analyse comparative du contrôle et de coffrets de poisson zèbre pour identifier les modifications de l’expression des gènes nouveaux et donnent un aperçu moléculaire de phénotypes d’intérêt.
Introduction
Analyse comparative de l’expression génique global est un outil précieux pour identifier de nouveaux gènes qui contribuent à des phénotypes observés. Ces analyses s’appuient généralement sur l’évaluation quantitative de l’abondance de transcription comparé entre expérimental et échantillons de contrôle. Des approches ciblées, telles que qRT-PCR sont relativement rapide et précis pour l’étude des modifications de l’expression génique unique. Séquençage de RNA (RNASeq) propose une approche large et exempt d’hypothèse pour identifier des changements significatifs dans l’expression génétique entre les échantillons, ce qui en fait désormais la norme pour de telles enquêtes à travers des systèmes expérimentaux.
Poisson zèbre sont apparus comme un modèle important sur de nombreux domaines de la maladie. Développé à l’origine pour leur utilité dans les études de biologie du développement, en raison de leur forte fécondité et relativement faible coût d’entretien, utilisation expérimentale du poisson-zèbre a évolué pour inclure un large éventail de phénotypes d’embryonnaire au stade adulte aussi bien comme un large éventail de moléculaire dosages1,2,3. En effet, ces atouts font des études mécanistes moléculaires rapide et rentable en raison de la facilité d’acquisition de grandes quantités de matériel combiné avec la facilité des manipulations génétiques et environnementale à tous les stades de la vie. En outre, le caractère transparent des embryons de poisson-zèbre et des larves le rendent idéal pour générer les lignes de journaliste transgéniques spécifiques aux cellules et tissus permettant en vivo visualisation des cellules discrètes des populations4. L’exploitation de ces lignes permet analyse d’expression génique global dans les types spécifiques de cellules isolées, basés sur l’expression du gène rapporteur.
Nous présentons ici un protocole complet pour l’analyse d’expression de gène global à l’aide de RNASeq après la culture d’embryons de poisson-zèbre. Des manipulations expérimentales génétiques, y compris morpholino (MO)-base de gène transitoire ou génome induite par CRISPR édition, ont été présentés ailleurs5,6,7. Nous donc se concentrer sur un protocole détaillé pour l’isolement de l’ARN d’embryons entiers ou trier des cellules transgéniques exprimant le journaliste suivies par simple analyse computationnelle des résultats RNASeq à l’aide d’outils de voie et termes de gene ontology (GO). Enfin, nous avons inclus une stratégie pour la validation des modifications de l’expression génique par transcriptase inverse quantitative PCR (qRT-PCR). Ces protocoles sont applicables aux embryons de poisson-zèbre soumis à un large éventail de conditions expérimentales, y compris la comparaison des mutants génétiques ou des conditions environnementales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approche décrite dans le présent protocole offre une stratégie relativement rapide et rentable pour l’analyse du transcriptome-niveau des animaux entiers ou des populations spécifiques de cellules triées. Le poisson-zèbre est un modèle avantageux pour ce type d’étude en raison de la facilité et la rapidité dans la production de grandes quantités d’à partir de matériau, la facilité de mise en œuvre de génétique ou environnementales conditions expérimentales et la disponibilité d’une grande s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) et T32DK098107 (T.L.H. et J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish. , (2002).
- Detrich, H. W., Zon, L., Westerfield, M. . The Zebrafish: Disease Models and Chemical Screens. , (2017).
- Detrich, H. W., Zon, L. I., Westerfield, M. . The Zebrafish: Genetics, Genomics, and Transcriptomics. , (2016).
- Detrich, H. W. . The Zebrafish: Genetics, Genomics and Informatics. , (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (109), (2016).
- . IDT Primerquest Tool Available from: https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index (2017)
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
- Leitch, C. C., Lodh, S., Prieto-Echague, V., Badano, J. L., Zaghloul, N. A. Basal body proteins regulate Notch signaling through endosomal trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 11), 2407-2419 (2014).
- Lodh, S., Hostelley, T. L., Leitch, C. C., O’Hare, E. A., Zaghloul, N. A. Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes. Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).
- Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes. BMC Genomics. 17, 318 (2016).
