Preparazione dei campioni e analisi dei dati di espressione genica basati su RNASeq dallo Zebrafish
Summary
Questo protocollo presenta un approccio per l’analisi del trascrittoma intero da embrioni di zebrafish, larve, o ordinato cells. Includiamo isolamento di RNA, analisi dei percorsi dei dati RNASeq e convalida qRT-PCR-basata di cambiamenti di espressione genica.
Abstract
L’analisi dei cambiamenti di espressione genica globale è uno strumento prezioso per identificare nuove vie sottostanti fenotipi osservati. Zebrafish è un eccellente modello per la valutazione rapida dell’intero trascrittoma da popolazioni di cellule intero animale o singoli a causa della facilità di isolamento di RNA da un gran numero di animali. Qui è presentato un protocollo per l’analisi di espressione genica globale negli embrioni di zebrafish mediante sequenziamento di RNA (RNASeq). Descriviamo la preparazione di RNA da interi embrioni o da popolazioni di cellule ottenute mediante cella ordinamento negli animali transgenici. Inoltre descriviamo un approccio per l’analisi dei dati di RNASeq per identificare percorsi arricchiti e termini di Ontology del Gene (vada) in insiemi di dati di espressione genica globale. Infine, forniamo un protocollo per la convalida dei cambiamenti di espressione genica utilizzando quantitativi d’inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli possono essere utilizzati per l’analisi comparativa di controllo e set sperimentali di zebrafish per identificare i cambiamenti di espressione del gene novello e forniscono la comprensione molecolare nei fenotipi di interesse.
Introduction
Analisi comparativa dell’espressione genica globale sono uno strumento prezioso per identificare nuovi geni che contribuiscono ai fenotipi osservati. Tali analisi in genere si basano sulla valutazione quantitativa dell’abbondanza di trascrizione rispetto tra sperimentale e campioni di controllo. Approcci mirati, ad esempio qRT-PCR sono relativamente rapida ed accurata indagine dei cambiamenti di espressione del singolo gene. Sequenziamento di RNA (RNASeq) offre un approccio ampio, privo di ipotesi per identificare i cambiamenti significativi nell’espressione genica tra campioni, rendendo ora lo standard per tali indagini attraverso sistemi sperimentali.
Zebrafish sono emersi come un modello prominente in molte aree di malattia. Originariamente sviluppato per la loro utilità negli studi di biologia dello sviluppo, grazie alla loro alta fecondità e relativamente basso costo di manutenzione, uso sperimentale di zebrafish è evoluto per includere una vasta gamma di fenotipi da embrionali a stadi adulti pure come un vasta gamma di molecolare dosaggi1,2,3. Infatti, questi vantaggi rendono molecolari studi meccanicistici rapido e conveniente a causa della facilità di acquisizione di grandi quantità di materiale combinato con la facilità di manipolazione sia genetica che ambientale in tutte le fasi della vita. Inoltre, la natura trasparente di zebrafish embrioni e le larve lo rendono ideale per la generazione di linee transgeniche reporter cellula – e tessuto-specifico permettendo visualizzazione in vivo di cella discreti popolazioni4. Lo sfruttamento di tali linee permette analisi di espressione genica globale in tipi di cellule isolate specifico basati sull’espressione del gene reporter.
Qui presentiamo un protocollo completo per l’analisi di espressione genica globale utilizzando RNASeq dopo la coltura degli embrioni di zebrafish. Manipolazioni genetiche sperimentali, tra cui morpholino (MO)-atterramento base gene transitoria o editing genomico CRISPR-mediata, sono state presentate altrove5,6,7. Abbiamo pertanto concentrarsi su un protocollo dettagliato per l’isolamento di RNA da interi embrioni o ordinato transgenici esprimenti reporter cells seguita da semplici analisi computazionale di RNASeq risultati utilizzando strumenti di percorso e termini di gene ontology (GO). Infine, abbiamo incluso una strategia per la validazione dei cambiamenti di espressione genica di quantitativi d’inversione di transcriptase PCR (qRT-PCR). Questi protocolli sono applicabili agli embrioni di zebrafish sottoposti a una vasta gamma di condizioni sperimentali, compreso il raffronto di mutanti genetici o condizioni ambientali.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’approccio descritto in questo protocollo offre una strategia relativamente rapida ed economica per livello transcriptome analisi di animali interi o popolazioni di specifiche cellule ordinato. Zebrafish fornisce un modello vantaggioso per questo tipo di studio per la facilità e la rapidità nel generare grandi quantità di avvio materiale, la facilità di implementazione genetico o ambientale condizioni sperimentali e la disponibilità di un grande spettro delle linee transgeniche reporter consentendo per isolamento d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.) e T32DK098107 (T.L.H. e J.E.N.).
Materials
| Commercial Reagents | |||
| TriZol | Thermo Scientific | 15596026 | lysis reagent |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | dissociation buffer 1 |
| FACSMax | Genlantis | T200100 | dissociation buffer 2 |
| DEPC-treated water | Sigma | 95284 | |
| FirstStrand cDNA conversion | Thermo Scientific | K1621 | cDNA conversion kit |
| 2X SYBR Green Master Mix | Roche | 4707516001 | qRT-PCR Master Mix |
| FACS buffer | Fisher Scientific | 50-105-9042 | |
| chloroform | Sigma Aldrich | 288306 | |
| sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish Strains | |||
| Tuebingen | ZIRC | ZL57 | |
| ins2a:mCherry | ZIRC | ZL1483 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 40 micron cell strainer | Sigma | CLS431750 | |
| FACS tube | BD Falcon | 352063 | |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Inverted Microscope | Zeiss | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Illumina HiSeq | Illumina | ||
| LightCycler 480 | Roche | ||
| Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set | Aquaneering | ZHCT100 | |
| FACS tube 5 mL polypropylene tube | BD Falcon | 352063 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel | Microsoft | ||
| Consensus Path DB | http://cpdb.molgen.mpg.de/ | ||
| GO Enrichment Analysis | http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis | ||
References
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