Protocolo para la síntesis en fase sólida de oligómeros de ARN que contiene un 2'-<emO</em> -tiofenilmetilo Modificación y caracterización mediante dicroísmo circular
Summary
Este artículo proporciona un procedimiento detallado sobre la síntesis en fase sólida, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN modificado en la posición C2'- O . Los análisis fotométricos del dicroísmo UV-vis y circular se usan para cuantificar y caracterizar aspectos estructurales, es decir , hebras simples o dobles.
Abstract
La síntesis en fase sólida se ha utilizado para obtener polímeros canónicos y modificados de ácidos nucleicos, específicamente de ADN o ARN, lo que la ha convertido en una metodología popular para aplicaciones en diversos campos y para diferentes propósitos de investigación. El procedimiento descrito en este documento se centra en la síntesis, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' que contiene cero, una o dos modificaciones situadas en la posición C2'- O . Las sondas se basan en grupos 2-tiofenilmetilo, incorporados en nucleótidos de ARN mediante síntesis orgánica estándar y se introducen en los oligonucleótidos correspondientes a través de sus respectivas fosforamiditas. Este informe hace uso de la química de la fosforamidita mediante las cuatro nucleobases canónicas (uridina (U), citosina (C), guanosina (G), la adenosina (A)), así como 2-tiofenilmetilo nucleótidos funcionalizados modificados en la 2'- O – posición; Sin embargo, la metodología es susceptible para una var grandeUna serie de modificaciones que se han ido desarrollando a lo largo de los años. Los oligonucleótidos se sintetizaron sobre un soporte de vidrio de poro controlado (CPG) seguido por escisión de la resina y desprotección bajo condiciones estándar, es decir , una mezcla de amoníaco y metilamina (AMA) seguida de fluoruro de hidrógeno / trietilamina / N-metilpirrolidinona. Los oligonucleótidos correspondientes fueron purificados mediante electroforesis de poliacrilamida (20% de desnaturalización) seguido de la elución, la desalinización, y el aislamiento a través de cromatografía de fase inversa (Sep-pak, C 18 -column). La cuantificación y los parámetros estructurales se evaluaron mediante el análisis fotométrico del dicroísmo (UV) y del dicroísmo circular (CD), respectivamente. Este informe pretende servir como un recurso y una guía para los investigadores principiantes y expertos interesados en embarcarse en este campo. Se espera que sirva como un trabajo en progreso a medida que se desarrollan nuevas tecnologías y metodologías. La descripción de las metodologías y técnicas dentro deS documento corresponden a un ADN / ARN sintetizador (renovado y comprado en 2013) que utiliza phosphoramidite química.
Introduction
La síntesis en fase sólida para obtener oligonucleótidos de ADN / ARN es una poderosa herramienta que ha servido a varias aplicaciones en diversos campos desde los años setenta 1 , 2 , 3 utilizando bloques de construcción de fosforamidita 4 . Ejemplos de su amplia influencia son: su impacto en el etiquetado (a través de las reacciones químicas) 5 , el sondeo estructural 6 y las tecnologías antisentido 7 , así como su elucidación de los mecanismos biológicos 8 , 9 , fuente como material genético 10 , y el estudio de Diversas modificaciones naturales y / o químicas 11 , 12 , entre muchos otros. La modificación que usamos aquí representa el primer paso en nuestros esfuerzos para obtener oligonucleótidos de ARN que contienenFotoactivas para permitir el control temporal de la estructura y función de este importante biopolímero.
La síntesis de dodecamers de ARN con secuencias: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [Agosto AUU CCG UAG] -3' (posiciones subrayadas representan la incorporación de una modificación -thiophenylmethyl C2'- O ) Constituye el foco de este estudio. Las secuencias se eligieron para permitir la cuantificación y medición de las cadenas de ARN como hebras individuales, o como sus correspondientes estructuras dúplex (no se predijeron otras estructuras secundarias como termodinámicamente estable). CD se utilizó para establecer los parámetros estructurales, es decir , la formación de dúplex y las transiciones de desnaturalización térmica.
Síntesis
El procedimiento general para obtener estos oligonucleótidos se ilustra en la Figura 1 y sigue el proceso escalonado: Síntesis de fase sólida automatizada → DeprOtección → Purificación → Cuantificación → Caracterización. La figura 2 muestra las unidades monoméricas que son necesarias en este procedimiento. La síntesis de ARN en fase sólida es similar a la del ADN en que se basa en la química de fosforamidita ( Figura 2 , izquierda) y el uso de grupos protectores lábil a bases para las aminas nucleófilas exocíclicas en G, A y C, por ejemplo , Acetilo, benzoilo, fenoxiacetilo, t – butilo o N , N – dimetilformamida ( Figura 2 , derecha). Un aspecto más a considerar en el ARN, debido a la presencia del grupo C2'-OH (carente de los biopolímeros desoxioligonucleótidos), es el paso adicional que ha de ser incorporado para la protección, y posterior desprotección, de esta posición nucleofílica. A este respecto, los grupos protectores basados en silicio se han convertido en una estrategia atractiva debido a su potencial como restos biortogonalesY desprotegidos en presencia de fluoruro), con los grupos tert- butildimetilsililo (TBDMS) y triisopropilsililoximetilo (TOM) como opciones populares ( Figura 2 , parte inferior izquierda).
En este trabajo, la síntesis automatizada se llevó a cabo en un sintetizador de ADN / ARN que utiliza química estándar de fosforamidita. Los ajustes del fabricante en el instrumento incluyen un paso de dilución automatizado cuando se usan las versiones comerciales de las fosforamiditas para el ADN, o la opción de diluir a volúmenes establecidos por el usuario. Sin embargo, decidimos pesar el ARN fosforamidita y diluir manualmente, dado que: 1) el precio de las fosforamiditas canónicas del ARN es más alto (hasta 50 veces más caro en algunos casos); 2) las fosforamiditas modificadas se obtienen a menudo en pequeñas cantidades; Y 3) la cantidad de material desperdiciado al usar una etapa de dilución automática (establecida por el fabricante) es grande. Además, utilizamos: 1) soportes sólidos disponibles comercialmente(Por ejemplo , CPG) que contiene una nucleobase protegida para funcionar como el extremo 3 '; Y 2) fosforamiditas comerciales (nucleobases canónicas) protegidas con un grupo TBDMS en la posición C2'- O . La lista detallada de las etapas de síntesis se proporciona en la Figura 3 y la Tabla 1 , junto con una descripción y comentarios adicionales para las etapas que se ajustaron para la síntesis de ARN. Además, la Figura 4 ilustra los rendimientos escalonados que se observan para cada paso después de seleccionar la opción 'Trityl Monitor', que cuantifica el catión trityl liberado de cada paso de detritylation.
Vale la pena señalar que típicamente, en nuestra experiencia, el factor limitante fue la obtención de la fosforamidita que contenía la modificación deseada. Es decir, el desarrollo de una metodología sintética que permita la incorporación de modificaciones en sitios selectos. En este informe, nos centramos en laIncorporación de un nucleótido modificado para el que hemos establecido la correspondiente metodología sintética, el grupo C2'- O- tiofenilmetilo. Este grupo es de pequeño tamaño y no afecta de ninguna manera a la síntesis en fase sólida. Dado que se ha descrito la incorporación de este grupo en oligonucleótidos de ARN, junto con parámetros estructurales y termodinámicos 4 , no se describirán en la presente memoria ningún aspecto de la síntesis orgánica que conduzca a las fosforamiditas modificadas.
Desprotección, purificación y caracterización
La desprotección de las aminas exocíclicas y grupos β-cianoetilo se produce en el mismo paso que el de la escisión de la resina CPG. Se aplicaron las condiciones comúnmente utilizadas para calentar la resina obtenida en presencia de una solución acuosa de AMA, seguido de escisión de los grupos C2'- O- sililo en presencia de iones fluoruro, y después purificación vía gelElectroforesis. Mientras que éstos se han convertido en condiciones estándar en muchos casos, modificaciones que son lábiles a las condiciones básicas o iones fluoruro pueden requerir condiciones más suaves 13, 14, por ejemplo, carbonato de metanol / potasio (MeOH / K 2 CO 3), o butilamina. Por lo tanto, es necesario un conjunto diferente de grupos protectores sobre las correspondientes fosforamiditas. Además, elegimos la electroforesis como la alternativa preferida para purificar los oligómeros desprotegidos, dada nuestra experiencia previa con este método y la falta de otra instrumentación. Sin embargo, la HPLC se puede utilizar alternativamente como un método eficaz 15 . La caracterización de los oligonucleótidos purificados se realizó mediante espectrometría de masas, desorción / ionización láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), utilizando un procedimiento informado por nuestro grupo 16 .
La caracterización estructural y La estabilidad de los dúplex obtenidos se realizó por CD. Específicamente, hacemos uso de CD para determinar las transiciones de desnaturalización térmica de oligonucleótidos modificados y no modificados de ARN siguiendo la disminución de la elipticidad de la banda a aprox. 270 nm, así como la desaparición de la banda (con elipticidad negativa) con una max λ a 210 nm. Se proporciona una comparación de espectros antes y después de la hibridación para ilustrar sus diferencias y proporcionar validación de la metodología empleada. El uso de CD es ampliamente aceptado en la determinación de motivos estructurales en ácidos nucleicos y aminoácidos 17 , y por lo tanto puede ser empleado como una herramienta para determinar diversos parámetros estructurales y termodinámicos 18 ; Sin embargo, no hay muchos ejemplos donde la técnica se utiliza para evaluar las transiciones de desnaturalización térmica. Algunos casos incluyen la determinación de la estabilidad térmica en el ADN que contiene G-quadruplexesAss = "xref"> 19 , 20 o en dúplex y horquillas de ARN 21 .
Este informe tiene la intención de proporcionar al lector no experto o espectador con un conjunto de herramientas que permiten un buen comienzo a este tipo de investigación. Servirá para mejorar y comparar con metodologías y técnicas en otros laboratorios de investigación que están involucrados en esta emocionante rama de la ciencia. El contenido de este informe se suma a los protocolos existentes de esta tecnología de diversas fuentes, y enriquece y facilita la experiencia con una ayuda visual para cada paso.
Protocol
Representative Results
Discussion
La intención de este manuscrito es servir de guía a los investigadores en el campo, principiante o experto, para lograr con éxito o mejorar la síntesis de oligonucleótidos de ADN o ARN. La metodología descrita se centra en el uso de síntesis en fase sólida utilizando un sintetizador de ADN / ARN automatizado a través de la química estándar de fosforamidita. El informe describe una descripción paso a paso de la síntesis, purificación y caracterización de dodecámeros de ARN. Además, se utiliza el uso de C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Preparación de este manuscrito fue apoyado a través de fondos de puesta en marcha de la Universidad de Colorado Denver (JMRE). AF quiere agradecer el apoyo de un premio de Investigación y Actividades Creativas (RaCAS, CU Denver). Se reconoce la financiación de la Oficina de Servicios de Investigación de la Universidad de Colorado Denver para cubrir los gastos de publicación. Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio, la Sra. Cassandra Herbert y el Sr. Yannick K. Dzowo por sus contribuciones en la parte de video.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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