Protokol for fastfasesyntese av oligomerer av RNA inneholdende en 2'-<em> O</em> -tiofenylmetylmodifikasjon og karakterisering via sirkulær dikroisme
Summary
Denne artikkelen gir en detaljert prosedyre for fastfasesyntese, rensing og karakterisering av dodekamerer av RNA modifisert ved C2'- O- posisjonen. UV-vis og sirkulær dikroisme fotometriske analyser brukes til å kvantifisere og karakterisere strukturelle aspekter, dvs. enkeltstrenger eller dobbeltstrenger.
Abstract
Fastfasesyntese har blitt brukt til å oppnå kanoniske og modifiserte polymerer av nukleinsyrer, spesielt av DNA eller RNA, som har gjort det til en populær metodikk for applikasjoner i forskjellige felt og for forskningsmessige formål. Fremgangsmåten beskrevet heri fokuserer på syntese, rensing og karakterisering av dodekamerer av RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' som inneholder null, en eller to modifikasjoner lokalisert ved C2'- O- posisjonen. Sondene er basert på 2-tiofenylmetylgrupper, innlemmet i RNA-nukleotider via standard organisk syntese og introdusert i de tilsvarende oligonukleotider via deres respektive fosforamiditter. Denne rapporten benytter fosforamidittkjemi via de fire kanoniske nukleobasene (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)), samt 2-tiofenylmetylfunksjonaliserte nukleotider modifisert ved 2'- O- posisjon; Metoden er imidlertid mulig for en stor varÅtti av modifikasjoner som har blitt utviklet gjennom årene. Oligonukleotidene ble syntetisert på en støtte med kontrollert pore glass (CPG) etterfulgt av spaltning fra harpiksen og avbeskyttelse under standardbetingelser, dvs. en blanding av ammoniakk og metylamin (AMA) etterfulgt av hydrogenfluorid / trietylamin / N-metylpyrrolidinon. De tilsvarende Oligonukleotidene ble renset ved polyakrylamid-elektroforese (20% denaturering), etterfulgt av eluering, avsalting, og isolering via reversfase-kromatografi (Sep-pak, C 18 -column). Kvantifisering og strukturelle parametere ble vurdert ved henholdsvis ultraviolett synlig (UV-vis) og sirkulær dikroisme (CD) fotometrisk analyse. Denne rapporten tar sikte på å fungere som en ressurs og veiledning for nybegynnere og ekspertforskere som er interessert i å starte på dette feltet. Det forventes å fungere som et arbeid i gang som nye teknologier og metodikker utvikles. Beskrivelsen av metodene og teknikkene innen denneS dokument samsvarer med en DNA / RNA synthesizer (renovert og kjøpt i 2013) som bruker fosforamiditt kjemi.
Introduction
Fastfasesyntese for å oppnå oligonukleotider av DNA / RNA er et kraftig verktøy som har betjent flere applikasjoner på forskjellige felt siden 1970s 1 , 2 , 3 ved bruk av fosforamidittbyggingsblokker 4 . Eksempler på sin brede innflytelse er: dens innflytelse i merking ( via klikkkjemereaksjoner) 5 , strukturundersøkelse 6 og antisense-teknologier 7 , samt dets belysning av biologiske mekanismer 8 , 9 , kilde som genetisk materiale 10 og studiet av Ulike naturlige og / eller kjemiske modifikasjoner 11 , 12 blant mange andre. Modifikasjonen som vi bruker her representerer det første trinnet i vår innsats for å oppnå RNA-oligonukleotider som inneholderFotoaktive prober for å muliggjøre temporal kontroll av struktur og funksjon av denne viktige biopolymeren.
Syntesen av RNA-dodecamers med sekvensene: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [august AUU CCG UAG] -3' (understrekede posisjoner representerer inkorporering av en C2'- O -thiophenylmethyl modifikasjon ) Utgjør fokus for denne studien. Sekvensene ble valgt for å muliggjøre kvantifisering og måling av RNA-tråder som enkle tråder, eller som deres tilsvarende dupleksstrukturer (ingen andre sekundære strukturer ble spådd som termodynamisk stabile). CD ble brukt til å etablere strukturelle parametere, dvs. tosidig formasjon og termiske denatureringsoverganger.
syntese
Den generelle fremgangsmåte for å oppnå disse oligonukleotidene er illustrert i figur 1 og følger trinnvis prosess: automatisert fastfasesyntese → DeprOteksjon → rensing → kvantifisering → karakterisering. Figur 2 viser de monomere enhetene som er nødvendige i denne prosedyren. Fastfasesyntese av RNA er lik den for DNA ved at den er basert på fosforamidittkjemi ( figur 2 , venstre) og bruk av baselabile beskyttelsesgrupper for de nukleofile eksosykliske aminer på G, A og C, f.eks . Acetyl, benzoyl, fenoksyacetyl, t- butyl eller N , N- dimetylformamid ( figur 2 , høyre). Et annet aspekt å vurdere i RNA, på grunn av tilstedeværelsen av C2'-OH-gruppen (mangler i deoksyoligonukleotidbiopolymerene), er det ytterligere trinn som må inkorporeres for beskyttelse og etterfølgende avbeskyttelse av denne nukleofile posisjon. I dette henseende har silisiumbaserte beskyttelsesgrupper blitt en attraktiv strategi på grunn av deres potensial som biorthogonale deler (spesifikkallY deprotected i nærvær av fluor), med tert- butyldimetylsilyl (TBDMS) og triisopropylsilyloxymethyl (TOM) grupper som populære valg ( Figur 2 , nederst til venstre).
I dette arbeidet ble den automatiserte syntesen utført på et DNA / RNA syntetiseringsmiddel som benytter standard fosforamidittkjemi. Produsentens innstillinger på instrumentet inkluderer et automatisert fortynningstrinn ved bruk av kommersielle versjoner av fosforamidittene for DNA, eller muligheten til å fortynne i volumer satt av brukeren. Imidlertid bestemte vi oss for å veie RNA fosforamiditt og fortynne manuelt gitt at: 1) prisen på kanoniske fosforamiditter av RNA er høyere (opptil 50 ganger dyrere i noen tilfeller); 2) de modifiserte fosforamidittene oppnås ofte i små mengder; Og 3) mengden spildt materiale ved bruk av et automatisert fortynningstrinn (sett av produsent) er stor. I tillegg brukte vi: 1) kommersielt tilgjengelige faste bærere( F.eks . CPG) som inneholder en beskyttet nukleobase for å fungere som 3'-enden; Og 2) kommersielle fosforamiditter (kanoniske nukleobaser) beskyttet med en TBDMS-gruppe ved C2'- O- posisjonen. Den detaljerte listen over syntesetrinnene er gitt i figur 3 og tabell 1 sammen med ytterligere beskrivelse og kommentarer for trinn som ble justert for RNA-syntesen. Videre illustrerer figur 4 de trinnvise utbyttene som observeres for hvert trinn etter å ha valgt alternativet Trityl Monitor, som kvantiserer trityl-kationen frigitt fra hvert detrityleringstrinn.
Det er verdt å merke seg at det i vår erfaring vanligvis var begrensningsfaktoren å oppnå fosforamiditten som inneholdt den ønskede modifikasjon. Det vil si utviklingen av en syntetisk metodikk som muliggjør inkorporering av modifikasjoner på utvalgte steder. I denne rapporten fokuserer vi påInkorporering av et modifisert nukleotid for hvilket vi har etablert den tilsvarende syntetiske metode, C2'- O- tiofenylmetylgruppen. Denne gruppen er liten i størrelse og påvirker ikke fastfasesyntese på noen måte. Siden inkorporering av denne gruppen i oligonukleotider av RNA er blitt rapportert, sammen med strukturelle og termodynamiske parametere 4 , vil ingen aspekter av den organiske syntesen som fører til de modifiserte fosforamiditter, bli beskrevet her.
Avbeskyttelse, rensing og karakterisering
Avbeskyttelsen av de eksocykliske aminer og ß-cyanoetylgrupper skjer i samme trinn som for spaltningen fra CPG-harpiksen. Vi anvendte de vanlige betingelser for oppvarming av den oppnådde harpiks i nærvær av en vandig løsning av AMA, etterfulgt av spalting av C2'- O- silylgruppene i nærvær av fluoridioner, og deretter rensing via gelelektroforese. Selv om disse er blitt standard betingelser i mange tilfeller, modifikasjoner som er labil overfor basiske betingelser eller fluoridioner kan kreve mildere betingelser 13, 14, for eksempel, metanol / kaliumkarbonat (MeOH / K 2 CO 3), eller butylamin. Dermed er et annet sett med beskyttende grupper på de tilsvarende fosforamiditter nødvendige. Videre valgte vi elektroforese som det foretrukne alternativet til å rense de beskyttede oligomerer gitt vår tidligere erfaring med denne metoden og mangelen på annen instrumentering. HPLC kan imidlertid alternativt brukes som en effektiv metode 15 . Karakterisering av de rensede oligonukleotidene ble utført via massespektrometri, matriseassistert laser desorpsjon / ioniserings-tid for avgang (MALDI-TOF) ved bruk av en rapportert prosedyre av vår gruppe 16 .
Strukturell karakterisering og ther Malstabilitet av de oppnådde dupleksene ble utført via CD. Spesielt bruker vi CD til å bestemme termiske denatureringsovergangene av modifiserte og umodifiserte oligonukleotider av RNA ved å følge nedgangen i båndets elliptisitet ved ca. 270 nm, samt båndets forsvunnelse (med negativ elliptisitet) med en A max ved 210 nm. En spektra sammenligning før og etter hybridisering er gitt for å illustrere deres forskjeller og gi validering av den anvendte metodikken. Bruken av CD er allment akseptert ved bestemmelse av strukturelle motiver i nukleinsyrer og aminosyrer 17 og kan derfor anvendes som et verktøy for å bestemme forskjellige strukturelle og termodynamiske parametere 18 ; Det er imidlertid ikke mange eksempler hvor teknikken brukes til å vurdere termiske denatureringsoverganger. Noen tilfeller inkluderer bestemmelse av termiske stabiliteter på DNA som inneholder G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplekser og hårnål av RNA 21 .
Denne rapporten har til hensikt å gi den ikke-ekspert leseren eller seeren et sett med verktøy som muliggjør en jevn start på denne typen forskning. Det vil tjene til å forbedre og sammenligne med metodikker og teknikker ved andre forskningslaboratorier som er involvert i denne spennende naturvitenskapen. Innholdet i denne rapporten legger til de eksisterende protokollene fra denne teknologien fra ulike kilder, og beriker og letter opplevelsen med et visuelt hjelpemiddel for hvert trinn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hensikten med dette manuskriptet er å tjene som veiledning for forskere på feltet, nybegynner eller ekspert, for vellykket oppnåelse eller forbedring av syntesen av oligonukleotider av DNA eller RNA. Den beskrevne metodikk fokuserer på bruken av fastfasesyntese ved å bruke et automatisert DNA / RNA-syntetiseringsmiddel via standard fosforamidittkjemi. Rapporten beskriver en trinnvis avbildning av syntese, rensing og karakterisering av RNA-dodekamerer. I tillegg benyttes bruk av CD for å identifisere sekundære str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forberedelse av dette manuskriptet ble støttet via oppstartsmidler fra University of Colorado Denver (JMRE). AF ønsker å anerkjenne støtte fra en Research and Creative Activities-pris (RaCAS, CU Denver). Finansiering fra Office of Research Services, University of Colorado Denver for å dekke publiseringsgebyrer, er anerkjent. Vi vil gjerne takke labmedlemmene Cassandra Herbert og Mr. Yannick K. Dzowo for deres bidrag i videodelen.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
