Protokoll för fastfassyntesen av oligomerer av RNA innehållande en 2'-<em> O</em> -tiofenylmetylmodifiering och karakterisering via cirkulär dikroism
Summary
Denna artikel tillhandahåller ett detaljerat förfarande på syntesen i fast fas, rening och karakterisering av dodekamerer av RNA modifierad vid C2'- O- positionen. UV-vis och cirkulär dikroismfotometriska analyser används för att kvantifiera och karaktärisera strukturella aspekter, dvs singelsträngar eller dubbelsträngar.
Abstract
Fastfassyntes har använts för att erhålla kanoniska och modifierade polymerer av nukleinsyror, specifikt av DNA eller RNA, vilket har gjort det till en populär metod för tillämpningar inom olika områden och för olika forskningsändamål. Förfarandet som beskrivs häri fokuserar på syntes, rening och karakterisering av dodekameror av RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' innehållande noll, en eller två modifieringar placerade vid C2'- O- positionen. Proberna är baserade på 2-tiofenylmetylgrupper, inkorporerade i RNA-nukleotider via standard organisk syntes och införda i motsvarande oligonukleotider via deras respektive fosforamiditer. Denna rapport använder fosforamiditkemi via de fyra kanoniska nukleobaserna (Uridin (U), Cytosin (C), Guanosin (G), Adenosin (A)), såväl som 2-tiofenylmetylfunktionaliserade nukleotider modifierade vid 2'- O- placera; Metoden är dock möjlig för en stor varTjugo modifieringar som har utvecklats under åren. Oligonukleotiderna syntetiserades på ett stöd med kontrollerad pore glas (CPG) följt av klyvning från hartset och avskyddning under standardbetingelser, dvs en blandning av ammoniak och metylamin (AMA) följt av vätefluorid / trietylamin / N-metylpyrrolidinon. De motsvarande oligonukleotiderna renades via polyakrylamidelektrofores (20% denaturerande) följt av eluering, avsaltning, och isolering via omvänd fas-kromatografi (Sep-pak, C 18-kolonn). Kvantifiering och strukturella parametrar utvärderades via ultraviolett synlig (UV-vis) respektive cirkulär dikroism (CD) fotometrisk analys. Denna rapport syftar till att fungera som en resurs och guide för nybörjare och experter som är intresserade av att gå in på detta område. Det förväntas fungera som ett pågående arbete som ny teknik och metodik utvecklas. Beskrivningen av metoder och tekniker inom dessaS dokument motsvarar en DNA / RNA synthesizer (renoverad och köpt år 2013) som använder fosforamiditkemi.
Introduction
Solidfassyntes för att erhålla oligonukleotider av DNA / RNA är ett kraftfullt verktyg som har fungerat flera applikationer på olika områden sedan 1970-talet 1 , 2 , 3 med användning av fosforamiditbyggnadsblock 4 . Exempel på dess breda inflytande är: dess inverkan på märkning ( via klickkemiska reaktioner) 5 , strukturundersökning 6 och antisensteknik 7 samt dess belysning av biologiska mekanismer 8 , 9 , källa som genetiskt material 10 och studien av Olika naturliga och / eller kemiska modifieringar 11 , 12 bland många andra. Modifieringen som vi använder här representerar det första steget i våra ansträngningar för att erhålla RNA-oligonukleotider som innehållerFotoaktiva sonder för att möjliggöra temporär kontroll av strukturen och funktionen hos denna viktiga biopolymer.
Syntesen av RNA-dodecamers med sekvenser: 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [augusti AUU CCG UAG] -3' (understrukna positionerna representerar införlivandet av en C2'- O -thiophenylmethyl modifiering ) Utgör fokus för denna studie. Sekvenserna valdes för att möjliggöra kvantifiering och mätning av RNA-strängar som enskilda strängar eller som deras motsvarande duplexstrukturer (inga andra sekundära strukturer förutspåddes som termodynamiskt stabila). CD användes för att fastställa strukturella parametrar, dvs duplexbildning och termiska denatureringsövergångar.
Syntes
Det övergripande förfarandet för att erhålla dessa oligonukleotider illustreras i figur 1 och följer stegvis process: automatiserad fastfassyntese → DeprOtektion → Rening → Kvantificering → Karakterisering. Figur 2 visar de monomerenheter som är nödvändiga vid denna procedur. Fastfassyntesen av RNA liknar den hos DNA genom att den är baserad på fosforamiditkemi ( Figur 2 , vänster) och användningen av baslabila skyddsgrupper för de nukleofila exocykliska aminerna på G, A och C, t.ex. Acetyl, bensoyl, fenoxiacetyl, t- butyl eller N , N- dimetylformamid ( Figur 2 , höger). En ytterligare aspekt att överväga i RNA, på grund av närvaron av C2'-OH-gruppen (saknar deoxyoligonukleotidbiopolymererna) är det ytterligare steget som måste införlivas för skyddet och efterföljande avskyddning av denna nukleofila position. I detta avseende har kiselbaserade skyddsgrupper blivit en attraktiv strategi på grund av deras potential som biortogonala delar (specificallY avskyddad i närvaro av fluorid), med tert- butyldimetylsilyl (TBDMS) och triisopropylsilyloximetyl (TOM) grupper som populära val ( Figur 2 , nedre vänster).
I detta arbete utfördes den automatiserade syntesen på en DNA / RNA-syntetiserare som använder standard fosforamiditkemi. Tillverkarens inställningar på instrumentet inkluderar ett automatiserat utspädningssteg när de kommersiella versionerna av fosforamiditerna används för DNA, eller alternativet att späda ut i volymer som användaren ställt. Men vi bestämde oss för att väga RNA fosforamiditen och späda ut manuellt med tanke på att 1) priset på kanoniska fosforamiditer av RNA är högre (upp till 50 gånger dyrare i vissa fall); 2) de modifierade fosforamiditerna erhålls ofta i små mängder; Och 3) mängden bortkastat material vid användning av ett automatiserat utspädningssteg (fastställd av tillverkaren) är stor. Dessutom använde vi: 1) kommersiellt tillgängliga fasta bärare( T.ex. CPG) innehållande ett skyddat nukleobas för att fungera som 3'-änden; Och 2) kommersiella fosforamiditer (kanoniska nukleobaser) skyddade med en TBDMS-grupp vid C2'- O- positionen. Den detaljerade listan över syntesstegen ges i figur 3 och tabell 1 tillsammans med ytterligare beskrivning och kommentarer för steg som justerades för RNA-syntesen. Vidare illustrerar figur 4 de stegvisa utbytena som observeras för varje steg efter att ha valt "Trityl Monitor" -alternativet, vilket kvantifierar trityl-kationen frigjord från varje detrityleringstrinn.
Det är värt att notera att den begränsande faktorn vanligtvis uppnådde, enligt vår erfarenhet, fosforamiditen innehållande den önskade modifieringen. Det vill säga utvecklingen av en syntetisk metod som möjliggör införlivande av modifieringar på utvalda platser. I denna rapport fokuserar vi påInkorporering av en modifierad nukleotid för vilken vi har etablerat motsvarande syntesmetod, C2'- O- tiiofenylmetylgruppen. Denna grupp är liten i storlek och påverkar inte fastfassyntesen på något sätt. Eftersom införlivandet av denna grupp i oligonukleotider av RNA har rapporterats, tillsammans med strukturella och termodynamiska parametrar 4 , kommer inga aspekter av den organiska syntesen som leder till de modifierade fosforamiditerna att beskrivas häri.
Deprotektion, rening och karaktärisering
Avlägsnandet av de exocykliska aminerna och ß-cyanoetylgrupperna sker i samma steg som klyvningen från CPG-hartset. Vi tillämpade de allmänt använda betingelserna för uppvärmning av det erhållna hartset i närvaro av en vattenhaltig lösning av AMA följt av klyvning av C2'- O- silylgrupperna i närvaro av fluoridjoner och därefter rening via gelelektrofores. Medan dessa har blivit standardbetingelser i många fall, modifikationer som är labila för basiska betingelser eller fluoridjoner kan kräva mildare betingelser 13, 14, t ex metanol / kaliumkarbonat (MeOH / K 2 CO 3), eller butylamin. Sålunda är en annan uppsättning skyddande grupper på motsvarande fosforamiditer nödvändig. Vidare valde vi elektrofores som det föredragna alternativet att rena de skyddade oligomererna med tanke på vår tidigare erfarenhet av denna metod och avsaknaden av annan instrumentering. HPLC kan emellertid alternativt användas som en effektiv metod 15 . Karakterisering av de renade oligonukleotiderna utfördes via masspektrometri, matrixassisterad laser desorption / joniseringstid för flygning (MALDI-TOF), med användning av en rapporterad procedur av vår grupp 16 .
Strukturell karaktärisering och därmed Malstabilitet hos de erhållna duplexema utfördes via CD. Specifikt använder vi CD för att bestämma termiska denatureringsövergångarna av modifierade och omodifierade oligonukleotider av RNA genom att följa minskningen i ellipticiteten hos bandet vid ca. 270 nm, samt försvinnandet av bandet (med negativ ellipticitet) med en λ max vid 210 nm. En spektrajämförelse före och efter hybridisering tillhandahålls för att illustrera deras skillnader och tillhandahålla validering av den använda metoden. Användningen av CD är allmänt accepterad vid bestämning av strukturella motiv i nukleinsyror och aminosyror 17 och kan därför användas som ett verktyg för att bestämma olika strukturella och termodynamiska parametrar 18 ; Det finns emellertid inte många exempel där tekniken används för att bedöma termiska denatureringsövergångar. Vissa fall innefattar bestämning av termiska stabiliteter på DNA innehållande G-quadruplexerAss = "xref"> 19 , 20 eller i duplex och hårnålar av RNA 21 .
Denna rapport avser att ge icke-expertläsaren eller tittaren en uppsättning verktyg som möjliggör en smidig start på denna typ av forskning. Det kommer att tjäna för att förbättra och jämföra med metoder och tekniker vid andra forskningslaboratorier som är inblandade i denna spännande forskningsgren. Innehållet i denna rapport lägger till de befintliga protokollen från denna teknik från olika källor och berikar och underlättar upplevelsen med visuellt hjälpmedel för varje steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med detta manuskript är att fungera som en guide till forskare inom fältet, nybörjare eller expert, för att framgångsrikt uppnå eller förbättra syntesen av oligonukleotider av DNA eller RNA. Den beskrivna metoden fokuserar på användningen av fastfassyntes med användning av en automatiserad DNA / RNA-syntetiserare via standard fosforamiditkemi. Rapporten beskriver en steg-för-steg-avbildning av syntesen, rening och karakterisering av RNA-dodekameror. Dessutom används användningen av CD för att ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Förberedelse av detta manuskript stöddes via startfonder från University of Colorado Denver (JMRE). AF skulle vilja erkänna stöd från en utmärkelse för forskning och kreativ verksamhet (RaCAS, CU Denver). Finansiering från Office of Research Services, University of Colorado Denver för att täcka publikationsavgifterna erkänns. Vi skulle vilja tacka labmedlemmarna Cassandra Herbert och Herr Yannick K. Dzowo för deras bidrag i videodelen.
Materials
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28-30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5-38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2′-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T. Click chemistry with DNA. Chem Soc Rev. 39, 1388-1405 (2010).
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified ‘ultra-mild’ DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2′-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA – a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses – A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2′-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. 14, 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -. L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D. Creating a ribonuclease-free environment. Methods Enzymol. 152 (2), 20-24 (1987).
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. . RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, 45-80 (2010).
