تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ
Summary
ويرد هنا تدفق الخلوي طريقة لتحديد الكمية نشاط السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية.
Abstract
ضمن نظام المناعة الفطرية، لمفاوية المستجيب المعروفة باسم خلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية تلعب دوراً أساسيا في الدفاع المضيف ضد الخلايا الشاذة، وعلى وجه الخصوص القضاء على الأورام وفيروسي إصابة الخلايا. حوالي 30 من عيوب monogenic المعروفة، جنبا إلى جنب مع مجموعة كبيرة من الحالات المرضية الأخرى، يسبب نقص الخلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، يظهر في انخفاض أو غياب النشاط السامة للخلايا. وتاريخيا، كانت قد أجرت التحقيق سيتوتوكسيسيتي مع أساليب المشعة، ومرهقة ومكلفة ويحتمل أن تكون خطرة. توضح هذه المقالة المطبقة سريرياً، تبسيط تدفق الخلوي طريقة لقياس نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. في هذا التحليل، خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو المنقي الاستعدادات خلية ناغورني كاراباخ المحتضنة شارك في نسب مختلفة مع خط خلية ورم المستهدف من المعروف أن حساسة إلى ناغورني كاراباخ بوساطة الخلايا سيتوتوكسيسيتي (نككك). الخلايا المستهدفة المسماة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح بالتمييز ضدهم من خلايا المستجيب (ناغورني كاراباخ الخلايا). بعد فترة الحضانة، يتم تحديد الخلايا الهدف قتل بوصمة حمض النووي، الذي يتخلل الخلايا الميتة على وجه التحديد. هذا الأسلوب هو قابلة للتشخيص وتطبيقات البحوث سواء، بفضل قدرات متعددة المعلمة التدفق الخلوي، ميزة إضافية يحتمل أن يتيح إجراء تحليل أعمق من ناغورني كاراباخ خلية النمط الظاهري ووظيفة.
Introduction
الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية مجموعة فرعية متطورة من الإنسان الفطرية لمفاوية المشاركة حاسمة في القضاء على الخلايا المصابة فيروسي وتحول الخلايا الأخرى المسببة للأمراض التهديدات 1،2. ناغورني كاراباخ خلية حبيبات الحال البيت البروتينات السامة للخلايا، مثل بيرفورين وجرانزيميس. عند التنشيط، ناغورني كاراباخ الخلايا تشكل تفاعل معقد مع أهدافها المعروفة باسم المشبك المناعية، حيث يتم الإفراج عن هذه الجزيئات عن محلياً، مما أدى إلى تحلل الخلية الهدف المباشر والمبرمج، إلى جانب الإفراج عن سيتوكين وتشيموكيني وفي نهاية المطاف في استحثاث التهابات الدولة 1،،من34.
ناغورني كاراباخ خلية التنشيط ينطوي على سلسلة معقدة من تفعيل والمثبطة التفاعلات بين ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات ويغاندس أعرب على سطح الخلايا المستهدفة، وتشكيل نظام محكم تنظيم. واحدة من أهم درس آليات تفعيل الخلية ناغورني كاراباخ هو “الذات المفقودة”. في الواقع، عدم الكشف عن فئة أنا الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC)، أو جزيئات مستضد (هلا) الكريات البيض البشرية، على المصابين أو تحول الخلايا المشغلات ناغورني كاراباخ خلية سيتوتوكسيسيتي. الورم والخلايا المصابة بالفيروسات عموما downregulate الخلية هذه المستضدات هربا من الحصانة T الخلية بوساطة، وبذلك أصبحت ناغورني كاراباخ الابتدائي الأهداف 1،،من34.
يتم تصنيف تقييم الدالة cell ناغورني كاراباخ أساسا إلى تحبب أو سيتوتوكسيسيتي فحوصات. ومع ذلك، فحوصات تحبب، مثل تدفق سيتوميتريك الكشف عن علامة تحبب المرتبطة CD107a، فقط إرشادية ناغورني كاراباخ خلية التنشيط وليس من وظيفتها في نهاية المطاف، قتل مباشرة من الخلايا الهدف 5،6،،من78. ومن ثم، اجتذب هذا القيد المحققين لفحوصات سيتوتوكسيسيتي كبديل أكثر دلالة وأكثر مباشرة.
منذ فترة طويلة “المعيار الذهبي” لتقييم الخلية بوساطة نشاط السامة للخلايا من خلايا تي وناغورني كاراباخ هو فحص الإصدار الكروم (CRA). CRA ينطوي على تسمية الخلايا المستهدفة مع 51Cr إشعاعيا وتفرخ لهم المشاركة مع خلايا المستجيب. هذا التحليل غارق في مبدأ أن تحلل الخلية يؤدي إلى الإفراج عن البروتين زمنياً 51Cr في المادة طافية، الذي يمكن أن يقاس بالعد غاما. هذا الفحص، بينما فعالة، وإشكالية بالنسبة لمجموعة متنوعة من الأسباب: ارتفاع تكاليف المواد ومعالجة والتخلص من المشعة 51Cr وعفوية الإفراج عن 51Cr وتوحيد صعبة–مما يجعل من غير العملي تماما 9،10.
منذ ذلك الحين وضعت عددا من الاختبارات غير المشعة، التي تشمل العلامات الفلورية والإفراج عن إنزيم، وحتى الإضاءة الحيوية، كبدائل لطعنة 11،12،،من1314. يصف لنا هنا تدفق الخلوي طريقة لقياس ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا نشاط في الخلايا الهدف K562 بسيطة وحساسة، واستنساخه. خلايا K562 هي خط خلية اريثروليوكيميك بشرية مع انخفاض التعبير عن فئة هلا أنا والتعبير المتزايد من يغاندس لمستقبلات أكتيفاتوري في ناغورني كاراباخ، مما يجعلهم عرضه بشكل خاص إلى ناغورني كاراباخ الخلية بوساطة سيتوتوكسيسيتي 15. في هذا التحليل، K562 الخلايا المسماة مسبقاً مع كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميديل إستر (CFSE) ومثقف شارك في نسب مختلفة مع أما خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو تنقيته ناغورني كاراباخ الخلايا 1. كفسي هو صبغة فلورسنت مستقرة وملزمة البروتين يسمح تمييز الخلايا المستهدفة من المستجيب ناغورني كاراباخ الخلايا 16،17. بعد الحضانة المشتركة، وصمة عار حمض النووي، على وجه التحديد تتخلل غشاء الخلايا الميتة، يستخدم لتحديد الخلايا الهدف قتل (انظر الجدول للمواد). ثم تكتسب العينات في سيتوميتير تدفق لتحديد النسبة المئوية للميت (أي، وصمة عار +) كفسي + الخلايا المستهدفة.
يمكن استخدام هذا الفحص كفحص تشخيصي روتيني monogenic العيوب التي تؤثر في حجرة خلية ناغورني كاراباخ، التي يوجد منها حوالي 30 العيوب المعروفة يسبب عوز خلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، وليمفوهيستيوسيتوسيس هيموفاجوسيتيك الابتدائي أو الثانوي. كما أنها مفيدة للتحقيق في نشاط الخلية ناغورني كاراباخ في المرضى مع القوباء المتكررة، وشديدة العدوى الفيروسية، لتقييم إعادة تشكيل المناعة بعد زرع الخلايا المكونة للدم أو وظيفة immunomodulatory العلاج 18،،من1920، ومجموعة كبيرة من تطبيقات البحوث الأساسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأسلوب الموصوفة هنا يوفر بديلاً واضحة وفعالة من حيث التكلفة للمقايسة الإفراج عن الجمهورية التشيكية التقليدية 51لتقييم نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. هذا الأسلوب هو حساس واستنساخه، وأقل استهلاكاً للوقت من الأساليب القياسية السابقة، مثل اللجنة السويسرية للطعون، ويم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر نارسيسو جيل، مركز إيمونوجينيتيكس، وجامعة كاليفورنيا لمساعدتها مع إعداد مخطوطة.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
