Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için
Summary
Kantitatif insan doğal katil hücrelerin sitotoksik etkinliğini belirlemek için Akış Sitometresi tabanlı yöntemi burada gösterilir.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık sistemi içinde doğal öldürücü (NK) hücreler olarak bilinen efektör lenfositler özellikle tumoral ortadan kaldırarak ve virally enfekte hücreleri anormal hücreler karşı konak savunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Diğer patolojik koşulları, bir dizi ile birlikte yaklaşık 30 bilinen monogenic kusur olarak tezahür fonksiyonel ya da klasik NK hücre eksikliği neden azalır veya yok sitotoksik etkinlik. Tarihsel olarak, sitotoksisite hantal, pahalı ve potansiyel olarak tehlikeli olan radyoaktif yöntemler ile araştırmış. Bu makalede NK hücre sitotoksik etkinliğini ölçmek için akıcı, klinik olarak geçerli Akış Sitometresi tabanlı yöntemi. Bu tahlil, periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) veya saf NK hücre hazırlıklar NK Hücre-aracılı sitotoksisite (NKCC) duyarlı olduğu bilinen bir hedef tümör hücre satırı ile birlikte farklı oranlarıyla inkübe. Hedef hücreleri önceden onların ayırımcılığa karşı efektör hücreler (NK hücreleri) izin vermek için bir floresan boya ile Etiketlenmiş. Kuluçka dönemi sonra öldürülen hedef hücreler özellikle ölü hücreleri nüfuz bir nükleik asit leke tarafından tanımlanır. Bu yöntem hem tanı ve araştırma uygulamaları hem de, Akış Sitometresi çok parametreli yetenekleri sayesinde mükellef, potansiyel olarak daha derin çözümlenmesi NK hücre fenotip ve işlevini etkinleştirme avantajı vardır.
Introduction
Doğal öldürücü (NK) hücreleri insan doğuştan gelen lenfositler eleştirel virally enfekte hücreleri, dönüştürülmüş hücreleri ve diğer patojen tehditler 1,2ortadan kaldırılması içinde yer alan sofistike bir alt kümesidir. NK hücre litik granül sitotoksik proteinler, perforin ve granzymes gibi ev. Etkinleştirme, üzerine NK hücreleri doğrudan hedef hücre lizis ve apoptosis, sitokin ve Kemokin yayın ile birlikte sonuçlanan nereye cytolytic bu moleküller yerel olarak serbest bırakılır, immünolojik synapse bilinen onların hedefleri olan karmaşık bir etkileşim oluşturmak ve sonuçta devlet bir enflamatuar indüksiyon içinde 1,3,4.
İnhibitör Hofstede NK hücre reseptörleri ve hedef hücreleri, sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir sistem yüzeyde ifade ligandlar ve NK hücre aktivasyonu etkinleştirme karmaşık bir dize içerir. Bir NK hücre aktivasyonu en çok çalışılan mekanizmaları “eksik” özdür. Nitekim, MHC kompleksi (MHC) veya insan lökosit antijeni (HLA) molekülleri, üzerinde büyük sınıf tespiti eksikliği enfekte veya hücreleri Tetikleyicileri NK hücre sitotoksisite dönüştürdü. Tümör ve virüs bulaşan hücreleri genellikle tümleyici böylece birincil NK olma, T Hücre-aracılı bağışıklık kaçmak için bu antijenleri hücre hedefler 1,3,4.
NK hücre işlevi değerlendirilmesi öncelikle kategorize içine degranulation ya da sitotoksisite deneyleri. Ancak, degranulation deneyleri, CD107a, degranulation ilişkili işaret akış sitometrik tespiti gibi sadece NK hücre aktivasyonu ve değil onların nihai işlevinin doğrudan hedef hücreleri 5,6,7,8öldürülmesi işaret etmektedir. Bu nedenle, bu sınırlama bir daha söylüyorum ve daha doğrudan alternatif olarak sitotoksisite deneyleri için müfettişler çekmiş olmalı.
Uzun süredir “altın T ve NK hücreleri Hücre-aracılı sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için standart” krom yayın tahlil (MKK) olduğunu. MKK radioactively hedef hücre 51Cr ile etiketleme ve onları ortak efektör hücreleri ile kuluçka içerir. Bu tahlil protein bağlı 51Cr gama sayarak ölçülen süpernatant, içine belgili tanımlık serbest bırakmak o hücre lizis sonuç ilke dolu olduğunu. Etkili, süre bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı sorunlu: yüksek malzeme maliyetleri, işleme ve bertaraf radyoaktif 51Cr, spontan yayın 51Cr ve zor standardizasyon – yapım o tamamen pratik 9,10.
Radyoaktif olmayan deneyleri, floresan etiketleme, enzim yayın ve hatta bioluminescence, ilgili bir dizi beri MKK 11,12,13,14alternatif olarak geliştirilmiştir. Biz burada bir Akış Sitometresi tabanlı yöntemi basit, hassas ve tekrarlanabilir NK hücre sitotoksik etkinliğini K562 hedef hücreleri üzerinde ölçüm için açıklamak. Bir insan erythroleukemic hücre satır HLA sınıf indirimli ifade ile ben ve onları NK Hücre-aracılı sitotoksisite 15özellikle duyarlı kılan ligandlar activatory NK reseptörleri için artan ifade K562 hücrelerdir. Bu tahlil K562 hücre carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) ile önceden etiketlenir ve işbirliği her iki periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) ile çeşitli oranları, kültürlü veya NK hücreleri 1saf. CFSE ayrımcılık hedef hücre efektör NK hücreleri 16,17sağlar bir istikrarlı, protein bağlayıcı floresan boya var. Co kuluçka sonra özellikle ölü hücreleri, membran permeating bir nükleik asit leke (malzemelerin tabloya bakın) öldürdü hedef hücreleri tanımlamak için kullanılır. Örnekleri sonra ölü (yani, leke +) yüzdesini belirlemek için bir Akış Sitometresi iktisap CFSE + hedef hücreleri.
Bu tahlil bir rutin tanı tarama olarak birincil veya ikincil Hemofagositik Lenfohistiyositozis ve orada olan yaklaşık 30 bilinen hataları NK hücre eksikliği, fonksiyonel veya klasik neden NK hücre bölmesi etkileyen monogenic kusurları için kullanılabilir. NK hücre etkinliği hastaların bağışıklık sulandırma hematopoietik hücre transplantasyonu veya post immunomodulatory terapi 18,19,20, aşağıdaki değerlendirmek için tekrarlayan, şiddetli herpes viral enfeksiyonlar ile ve temel araştırma uygulamaları bir dizi için araştırmak yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan NK hücre sitotoksik etkinliğini değerlendirmek için geleneksel 51Cr yayın tahlil için basit ve düşük maliyetli bir alternatif yöntemdir. Bu yöntem hassas, tekrarlanabilir ve MKK gibi önceki standart yöntemlerine göre daha az zaman alıcı ve klinik her ikisi-ebilmek var olmak kullanılmış ve uygulamaları araştırma.
Tahlil toplam PBMCs ve zenginleştirilmiş NK hücreleri ile çalışsa da, hücre popülasyonlarının arındırmak için gerek kal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jill Narciso, UCLA Immunogenetics Merkezi, el yazması hazırlık ile ona yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 Media | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | Stock solution at 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml) |
| K562 Cells | ATCC | CCL-243 | Cancer cell line |
| T-75 cell culture flasks | Corning | 431464 | |
| CFSE cell proliferation kit | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw. |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation. |
| Sodium/lithium heparin blood collection tubes | BD | 02-687-95 | |
| U-bottom 96-well plate | Corning | CLS3897 | |
| Serological pipettes | BD Falcon | ||
| Polystyrene round-bottom tubes (5mL) | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| Reagent reservoir | USA Scientific | 2321-2230 | |
| Human NK cell enrichment cocktail | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
References
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger?. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
- Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074 (2015).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
- Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357 (2014).
- Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
- West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
- Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
- Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
- Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152 (2016).
- Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
- Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578 (2015).
- Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
- Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
- Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
- Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1 (2015).
- Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).
