이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.
조합 유전자 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 단일 가닥 oligonucleotides 단일 자료 점 돌연변이, 종종 다양 한 인간 상속 된 장애에 대 한 책임은의 교정에 대 한 효과적인 전략 이다. 잘 설립 셀 기반 모델 시스템을 사용 하 여, HCT116 세포에 통합 단일 복사 돌연변이 eGFP 유전자의 점 돌연변이 복구 되었습니다이 조합 방식을 사용 하 여. 수정 하 고 수정 되지 않은 세포의 분석 대상 사이트를 둘러싼 DNA 시퀀스에서 수정 되지 않은 셀에서 indels를 만든 경우 유전자 편집의 정밀도 유전자 변의 개발 보여준다. 여기, 측정 대상 사이트에서 indel 형성 하는 상세한 실험 전략 함께 점 돌연변이의 유전자 편집이 조합 접근을 분석 하는 데 사용 하는 특정 방법론 설명 이다. 이 프로토콜 기초 접근 및 인간 치료에 대 한 편집 CRISPR/Cas9 기반 유전자를 개발 하기 위한 수사에 대 한 워크플로 설명 합니다. 이 작품의 결론 그 현장 mutagenesis 일어난다 CRISPR/Cas9 활동 결과로 포인트 돌연변이 복구의 과정에서 이다. 이 작업 장소에 임상 구현에 대 한 향하는 모든 접근의 중요 하 고 중요 한 부분 이어야 한다 mutagenesis의 정도 식별 하는 표준화 된 방법론을 박 았.
Mandecki (1986)에 의해 연구를 개척 oligonucleotides 박테리아1, Walder 동안 변모와 Walder (1986) 효 모2에서 비슷한 연구를 실시를 사용 하 여 플라스 미드 DNA에 영구적인 변화를 설명 했다. 잠시 후, 셔먼과 동료 출판 일련의 논문 단일 가닥 oligonucleotides 유전자3상속 변경 하 효 모 세포에 도입 되었다. 미생물 세포에서 정액 작품에 건물, Kmiec와 동료 포유류 세포4단일 기본 복구를 지시 하는 독특한 단일 에이전트 oligonucleotides 개발 하기 시작 했다. 이 개념은 베어링 RNA 분자 DNA 기초의 구성 보다는 대상 사이트에 더 긴밀 하 게 바인딩하는 생 화 확 적인 데이터를 기반으로 합니다. 공상 oligonucleotides5,,67를 사용 하 여 유전자 편집 성공의 수많은 보고 했지만 편집 수준 남아 실험 사이 및 다른 목표/셀에 걸쳐 매우 다양 조합입니다.
기증자가 단일 가닥 DNA는 DNA 이중 가닥 기증자에 게 선호 무작위로8게놈 내의 사이트를 통합 하는 때문입니다. 그러나, 것 도입된 단일 가닥 oligonucleotides 셀룰러 nucleases에 의해 급속 한 저하 하는 경향이 있다. 저하에서 oligonucleotides의 termini를 보호 하기 위해 몇 가지 전략을 채용 했습니다. Exonuclease 보호, 단일 가닥 DNA을 원하는 시퀀스를 포함 하는 0.1-1에서 편집 효율성을 얻기 위해 충분 한 % 범위6. 개선 하 고 보다 일관성 있는 transfection 기법, phenotypic 해독과 함께 더 일관 된 여러 연구 그룹8,,910,11, 편집 허용 12,13.
지난 10 년 동안 더 많은 의무가 유전자 편집 대상 셀 수 있도록 상당한 노력이 하고있다. 한 전략은 세포 주기14,,1516의 변조를 사용합니다. 에 도입 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs)와 정상적인 반응 조건 하에서 주파수를 편집 하는 동안 경작된 한 포유류 세포 0.1%와 1% 증가 3-에 5 배 때 편집 하는 유전자의 주파수 사이 였다는 oligonucleotides S 단계를 통해 그들의 전환 중 세포에 도입 되었다. 별도 일련의 실험, Brachman 및 Kmiec (2005) 시연 (3-5%)를 편집 하는 정확한 유전자의 상대적으로 높은 수준의 2’3 ‘ dideoxycytosine (ddC)는 oligonucleotide17의 추가 이전 24 시간에 대 한 셀에 알을 품을 때 가져온 . ddC는 DNA 복제 포크 운동, 제안 하는 활성 복제11,18의 지역으로 ODNs의 설립을 포함 한다 유전자 복제 가능성이 셀에 ssODNs에 의해 편집의 속도 감소 시킨다. 이러한 연구 기증자 DNA 유전자 편집, 행동의 진정한 메커니즘의 일환으로 성장 복제 포크에 통합 된다 개념에 찍은 더블-좌초 휴식 있는지 여부 또는 아니라19의 독립적인 함께. 따라서, 점 돌연변이의 수정 또는 염색체 내 DNA의 세그먼트의 교체는 DNA 페어링 및 단일 가닥 동화 통로 통해 발생합니다.
유도 하는 성장 하는 작은 분자 에이전트와 셀에 임의의 이중 가닥 DNA 나누기는 DNA 복제 이벤트는 실속 된 셀 피해20,21을 복구 하는 시도 환경을 만듭니다. 복제 포크의이 일시적인 침체 개선 대상 접근15단일 가닥 편집 oligonucleotides 여 chromatin 구조의 더 효율적인 침투를 수 있습니다. 이중 가닥 DNA의 창조 VP16, bleomycin, 같은 약물에 의해 휴식 또는 camptothecin22,23, 거의 10 배 수준으로 편집 하는 유전자를 자극을 보여왔다 최대 6-8%. 그러나, 무작위 이중 가닥 DNA 틈 치료 설정에서 바람직하지 않습니다.
프로그래밍 가능한 nucleases와 oligonucleotides 편집 진은 또한 세포 분열24,25. 동안 자극 핵 산 기반 배달 했다 동기화 된 HCT 116 셀에 수리 homology 감독을 수행 하는 데 사용 됩니다 때 리 베라-토레스와 동료 시연 활동을 대상으로 동일한 증가 때 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) 단일 가닥 oligonucleotides 복제 세포 인구26,27 에 둘 다 고용. 더 최근에, Bialk와 동료 단일 가닥 oligonucleotides와 단일 기본 돌연변이의 수리 및의 배열을 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 Cas9을 보여주었다 (CRISPR/Cas9) 분자 일어난다 더 높은 효능 때 셀 인구가 S 단계28을 이동 하 고 있다. CRISPR 분자 RNA 및 기능 대상 분열에 대 한 지정 된 DNA 시퀀스 내에 있는 영역을 식별 하는 구성 됩니다. Cas9는 세균성 효소의 기능은 nucleolytic 교환 반응에 이중 가닥 DNA를 쪼개 다입니다. 따라서, CRISPR, 게놈 목표에 복잡 한 위치 하 고 Cas9 nuclease 더블-좌초 휴식을 실행 합니다. 린 외. (2014) 또한 세포 주기 유전자의 높은 주파수를 달성 하기 위한의 중요성을 설명 했다 기본 신생아 섬유 아 세포, 인간 배아 줄기 세포에에서는 수정 된 CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) 복잡 한 중재 전달 시스템을 사용 하 여 편집 및 다른 셀 라인24. 따라서, 유전자 편집 및 단일 에이전트 유전자 편집에 대 한 세포 주기 진행 간에 설정 된 관계 조합 유전자 프로그래밍 가능한 nucleases 및 기증자 DNA 서식 파일을 사용 하 여 편집에 적용 됩니다. 동안 유전자 편집에 조합 접근을 가져왔다 함께 기증자 DNA 템플렛으로 파트너의 다양 한, 분야에 대부분 노동자 더블-좌초 휴식 기능을 제공 하 CRISPR/Cas9를 사용 합니다. 이 선택이 특정 유전자 도구와 함께 그것은 채택 될 수 있다 유전자 기능을 사용 하지 않도록 설정 하거나 특정 사이트에 DNA의 외국 작품을 소개 하는 유연성의 사용의 용이성에 입각 한입니다. 기술적으로 녹아웃의 세대 유전자 대체, 어디 질병 사이트에 유전자의 “올바른” 또는 정상의 합동 실행 되어야 한다 정밀도와 쉽게 비교 합니다. 연구원의 수는 식별 하 고 특정 약물과 돌연변이 기지의 교정 및 높은 주파수29에서 적절 한 위치에 정상 유전자 시퀀스의 삽입 시 약의 사용을 공부.
최근, 리 베라-토레스 외. 30 사용 조합 진 편집, 특별히 설계 된 CRISPR/Cas9 시스템 및 유전 정보를 복구 하는 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 DNA 템플렛에 의해 제공의 더블-좌초 휴식 활동을 활용 한 점 돌연변이향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자의 단일 복사본은 HCT116 셀에 통합. 저자가 잘 특징 모델 셀 라인 평가 대상 사이트를 둘러싼 분열의 특이성을 이용을 했다. 데이터는 대상 사이트에서이 존재, 특히 수정된 지점 돌연변이 포함 하지 않는 셀에서에서 공개. 이 원고에서 우리는 상세 하 고 집중이 노동자 현장 mutational이 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 만들어진 검사 하는 데 사용 하는 방법론에 따라.
편집 하는 유전자는 주로 CRISPR/Cas9 시스템의 출현 때문에 주류 과학 교과로 떠오르고 있다. 세균성 세포의 입양 면역을 용이 하 게,이 놀라운 통로 인간의 염색체에 있는 genomic 변경을 활성화 하는 분자 도구로 용도가 변경 했다. CRISPR/Cas9의 자연 함수는 바이러스 성 DNA 이중 가닥 DNA 나누기 조각화30,31선도 도입 하 여 사용 하지 않도록 합니다. 이 활동에서 외 인 DNA를 침입의 파괴 그리고 간결한 면역 같은 바이러스 성 입자에 의해 연속적인 감염을 억제 하는 리드. 놀랍게도,이 시스템 전시 폐 렴 성 문제, 그 이전 감염 이벤트에 의해 만들어진 특정 CRISPR gRNA를 다시 활성화할 수 있습니다.
효율성과 유전자 장애 CRISPR/Cas9에 의해 촉매의 정확도 사용 되었습니다 수많은 진 핵 유전자 시스템 목표 작동 유전자32,33를 사용 하지 않도록 했다. 기저 수준으로 감소, 프로세스의 두 가지 기본 단계 구성 되어 있습니다. 첫 번째 두 번째 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 녹아웃 완료의 고유의 프로세스에 의존 하는 동안 더블-좌초 휴식 이다. 대부분의 경우, 블런트-엔드의 창조에 더블-좌초 휴식 결과 버너 염색체 세그먼트, NHEJ에 관련 된 효소 염색체 틈에 반응 하 고 만들 깨진된 끝에 행동. 이 프로세스 때로는 절단된 사이트에서 개별 뉴클레오티드의 손실을 포함할 수 있다. 심지어 몇 기지의 손실 frameshift, 수 있고 기능 식 중단. NHEJ의 자연적인 과정을 참여 하 여 유전자 녹아웃을 만들 CRISPR/Cas9의 사용은 혁명 진 핵 세포 유전학; 대상 사이트에서 DNA의 손실 예측 가능 하 고 예상 되는.
유전자 녹아웃, 달리 연구자의 수 리디렉션 및 repurpose homology 감독 복구의 과정으로 CRISPR/Cas9 활동을 하려고에 종사 되었습니다. 연구의 목적은 유전자 수정입니다. 이 전략에 CRISPR/Cas9 선된 오류를 복구 하거나 건강 한 유전자에 돌연변이 삽입 하는 유전 정보를 제공 하는 기증자 DNA 템플렛와 결합 된다. 초기 보고서 homology 감독 수리를 진작에 CRISPR/Cas9의 놀라운 능력을 강조 표시 (직접 또는 간접적으로) 프로세스는 고도로 정밀한 패션24,34에서 발생 했습니다. 우리의 실험실 homology 감독 수리 또는 유전자 수정 사용 하 여 단일 가닥 oligonucleotides 시도 메커니즘 및15,17,18 그것을 둘러싼 규제 회로 정의 공부 하고있다 ,23. 우리 때문에 이것이 가장 기본적인 유전자 변이 많은 상속 된 장애에 대 한 책임 것으로 알려진 단일 지점 돌연변이 편집 진에 주로 집중 했다. 유전자 편집의 기본적인 지식을 우리의 indels의 형성에 유전자 녹아웃 결과에 CRISPR/Cas9 함수 이후 이러한 반응에 CRISPR/Cas9 활동의 정밀도 질문을 이끌었다. 우리 분명 reductionist 패션에서 현장 mutagenesis 연구, 선택 가능한 비 아직 임상 관련 유전자 보다는 잘 정의 된 모델 시스템 사용. 어떤 유전자에 따라 교정 모두 genotypic 및 phenotypic 수준에서 측정 될 수 있다 간단한 대상 유전자를 사용 하 여 우리 권유 대상 사이트에서 발생이 안정적이 고 강력한 패션에서 확인 될 수 있었다.
우리의 데이터 편집 시스템 확립 유전자 돌연변이 eGFP 구성 된 유전자 HCT116 셀에 통합 제공할 수 있는 유전 병 변 및 현장 mutagenesis의 프로세스의 생성에 관한 기초 정보를 확인 합니다. CRISPR/Cas9 및 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 DNA 분자에서에서 일하고 eGFP 유전자의 점 돌연변이의 정확한 복구 될 수 있습니다. 우리는 기증자 DNA 돌연변이 기지, 우리가 정확한30을 불리는 과정의 수리에 대 한 복제 서식 파일 역할을 있는 분자 통로 점 돌연변이의 수리에 대 한 새로운 모델을 제안 합니다. 수정 된 표현 형을 전시 하지 대상된 인구 이기종 포함 하 고 DNA indels 대상 사이트를 둘러싼에 이르기까지 널리 셀의 다양 한 표시 됩니다. 교정된 인구에서 고립 약 절반 클론 삭제 mutagenesis 대상 사이트에서 관찰 되었다. 이후 이전 보고서는 단일 가닥 oligonucleotides 역할을 단일 에이전트 유전자 편집 도구 대상 사이트에서 indels를 일으킬 수 있다, 우리는 결론 CRISPR/Cas9 활동은이 돌연변이 대 한 책임을 표명 했다.
이 원고 대상 사이트에서 유전자이 안정적이 고 강력한 패션에서 측정 될 수 있도록 자세한 방법을 제공 합니다. 동안 엄청난 양의 주의 분석에 지급 되었습니다 그리고 오프 사이트 mutagenesis의 매핑, 이기종 돌연변이 대상 사이트에서 만든 임상 분야에서 편집 하는 유전자의 성패에 큰 영향을 미칠 것 같다. 추가 기술 또는 수정된 Cas9 단백질 포유류 세포35선 천 homology 감독 수리의 정밀도 개선 하는 데 필요한 수 있습니다. 이러한 기술 중 일부는 다리, 염색체 끝을 함께 들고 NHEJ의 파괴적인 행동을 피하고로 보조 oligonucleotides의 사용을 포함. 정의 진 편집 활동 결과로 대상 사이트에서이 정도 이며 치료 적 개입을 위한 어떤 프로토콜의 중요 한 부분이 되어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 아무 승인 있다.
McCoy’s 5A Modified medium | ATCC | 30-2007 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
L-glutamine | ATCC | 30-2214 | |
Penicillin-Streptomycin Solution | ATCC | 30-2300 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ATCC | 30-2200 | No Calcium or magnesium |
Trypsin EDTA Solution | ATCC | 30-2101 | |
Aphidicolin 1mg | Thermo Fisher | AC611970010 | |
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol | IDT | No catalog number since its made to your specific gene target. | |
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol | IDT | 1072533 | |
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg | IDT | 1074182 | |
IDTE Buffer | IDT | 11-01-03-01 | |
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm | VWR | 10497-474 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems | BioRad | 1652660 | |
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE) |
Sigma | 05470-1G | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | AM9260G | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69581 | |
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates | VWR | 10062-892 | |
Petri Dishes | Fisher | 12-565-90 | |
Conical Tubes (15 mL) (racked) | Thermo Fisher | AM12500 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 |