Nauwkeurige, High-throughput analyse van de bacteriële groei
Summary
Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is van essentieel belang voor het begrip van microbiële fysiologie als een verschijnsel systemen-niveau. Een protocol voor experimentele manipulatie en een analytische aanpak worden ingevoerd, waardoor nauwkeurige, high-throughput analyse van bacteriële groei, die een belangrijke onderwerp van belang in de systeembiologie.
Abstract
Bacteriële groei is een centraal concept in de ontwikkeling van moderne microbiële fysiologie, evenals in het onderzoek van cellulaire dynamiek op het niveau van de systemen. Recente studies hebben correlaties tussen bacteriële groei en genoom-brede evenementen, zoals genoom vermindering en transcriptome reorganisatie gemeld. Correct analyseren bacteriële groei is van cruciaal belang voor het begrijpen van de groei-afhankelijke coördinatie van gene functies en cellulaire componenten. Dienovereenkomstig, de precieze kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei in een high-throughput wijze is vereist. Opkomende technologische ontwikkelingen bieden nieuwe experimentele instrumenten waarmee updates van de methoden die worden gebruikt voor het bestuderen van de bacteriële groei. Het protocol hier geïntroduceerd maakt gebruik van een microplate-lezer met een geoptimaliseerde experimentele procedure voor de reproduceerbaar en nauwkeurige evaluatie van bacteriële groei. Dit protocol is gebruikt voor het evalueren van de groei van een aantal eerder beschreven Escherichia coli stammen. De belangrijkste stappen van het protocol zijn als volgt: de voorbereiding van een groot aantal cel voorraden in kleine flesjes voor herhaalde tests met reproduceerbare resultaten, het gebruik van 96-wells-platen voor high-throughput groei evaluatie en de handmatige berekening van twee grote parameters (d.w.z., maximale groei tarief en de bevolkingsdichtheid) vertegenwoordigen de groeidynamiek. In vergelijking met de traditionele kolonievormend eenheid (CFU) test, die het aantal cellen dat na verloop van tijd op agar platen in glazen buizen worden gekweekt tellen, de huidige methode is efficiënter en biedt meer gedetailleerde temporele records van wijzigingen van de groei, maar heeft een strengere aantoonbaarheidsgrens op lage bevolkingsdichtheid. Kortom is de beschreven methode gunstig voor de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de high-throughput van bacteriële groei, die kan worden gebruikt om algemene conclusies te trekken of theoretische opmerkingen te maken.
Introduction
Microbiologisch onderzoek beginnen vaak met de cultuur van bacteriële cellen en de beoordeling van de curven van de bacteriële groei, die een fundamentele fenomeen van bacteriële fysiologie1,2,3te vertegenwoordigen. Cultuur van de fundamentele beginselen zijn verkrijgbaar in de gepubliceerde onderzoeksliteratuur en leerboeken omdat bacteriecultuur een fundamentele methode is. Op het niveau van de Bank, aanzienlijke aandacht traditioneel gericht geweest op het optimaliseren van de groei media en het kweken van voorwaarden, maar niet onder controle heeft de groei, die zou waarschijnlijk nog meer inzicht van microbiële fysiologie, is uitgebreid bestudeerde4. Voor exponentieel groeiende bacteriën, is een belangrijke parameter van de cellulaire staat het groeitempo op jaarbasis, die is gemeld moeten worden gecoördineerd met het genoom, transcriptome en Proteoom5,6,7,8 . Kwantitatieve evaluatie van bacteriële groei is dus cruciaal voor het begrip van microbiële fysiologie.
Om te beoordelen bacteriële groei, de experimentele methoden voor het schatten van biomassa zijn gevestigde9,10 en zijn gebaseerd op de detectie van biochemische, fysische of biologische parameters, zoals optische turbiditeit. Bovendien, zijn de analytische methoden gebruikt voor het vastleggen van de dynamische eigenschappen van groei veranderingen vaak gebaseerd op gevestigde niet-lineaire modellen11,12,13, bijvoorbeeld, logistieke vergelijkingen. Groeidynamiek worden over het algemeen verkregen door getimede bemonstering van celgroei in cultuur door het meten van optische troebelheid of kolonievormend eenheid (CFU) testen uitvoeren. De beperking van deze kweken en detectiemethoden worden vermeld is dat de gegevenspunten niet een getrouwe weergave van de populatiedynamiek zijn omdat de meting intervallen vaak in uren zijn en de cultuur-voorwaarde (bijvoorbeeldveranderingen in temperatuur en beluchting) wordt verstoord ten tijde van de bemonstering. Cultuur- en analysetechnieken moeten worden bijgewerkt met behulp van de recente ontwikkelingen in technologie en begrip. Recente vooruitgang in microplate lezers toestaan het real-time opvolgen van bacteriële groei en leiden tot aanzienlijke afname van de kosten van arbeid. Met behulp van deze geavanceerde apparaten, hebben de meest recente studies op bacteriële groei gemeld analysemethoden voor high-throughput metingen14,15.
Het doel van dit protocol is ter beoordeling van de precieze groeidynamiek in een high-throughput wijze, die zullen waardevol voor kwantitatieve studies die uiteindelijk betrekking hebben op de vragen van hoe de groei wordt bepaald en welke factoren beïnvloeden de groei. Het protocol adressen alle factoren die worden in aanmerking voor de herhaalbare en nauwkeurige kwantificatie van bacteriële groei genomen moeten. De experimentele methode en analyse worden in detail in de hoofdtekst beschreven. Deze methode kunnen de nauwkeurige en reproduceerbare analyse van bacteriegroei in zodanig hoge gegevensdoorvoer. Microbiologen kunnen dit protocol gebruiken om extra kwantitatieve resultaten ontlenen hun experimenteel bewijs. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor studies in systeembiologie die proberen om algemene conclusies te trekken of om een theoretische overzicht van groei.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in het protocol zijn de voorbereiding van een gewone aandelen van exponentieel groeiende cellen en de replicatie van de dezelfde monsters in meerdere putten op verschillende posities op de microplate. Eerder, microbiologen begonnen de cultuur van een overnachting pre cultuur. Hoewel deze methode de vertragingstijd van bacteriële groei verminderen kan, is het moeilijk om reproduceerbare groeikrommes. Zoals blijkt uit Figuur 2, resulteerde de onafhankelijke metingen met behu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
