Exakt, High-throughput analys av bakterietillväxt
Summary
Kvantitativ utvärdering av bakteriell tillväxt är nödvändig för att förstå mikrobiell fysiologi som system-nivå fenomen. Ett protokoll för experimentell manipulation och en analytisk metod introduceras, vilket möjliggör precisa, hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som är en viktig fråga av intresse i systembiologi.
Abstract
Bakteriell tillväxt är ett centralt begrepp i utvecklingen av moderna mikrobiell fysiologi, liksom i utredningen av cellulära dynamics på systemnivå. Nyligen genomförda studier har rapporterat korrelationer mellan bakterietillväxt och genome-wide händelser, såsom genomet minskning och transkriptom omorganisation. Korrekt analysera bakterietillväxt är avgörande för att förstå tillväxt-beroende samordning av genen funktioner och cellulära komponenter. Följaktligen krävs den precisa kvantitativa utvärderingen av bakterietillväxt på ett sätt som hög genomströmning. Framväxande tekniska utvecklingen erbjuder nya experimentella verktyg som tillåter uppdateringar av de metoder som används för att studera bakterietillväxt. Protokollet införs här sysselsätter en microplate reader med en mycket optimerad experimentell förfarande för reproducerbara och exakt utvärdering av bakterietillväxt. Detta protokoll användes för att utvärdera tillväxten av flera tidigare beskrivits Escherichia coli stammar. De viktigaste stegen i protokollet är följande: utarbetandet av ett stort antal cell bestånd i små flaskor för upprepade tester med reproducerbara resultat, användning av 96 brunnar för hög genomströmning tillväxt utvärdering och manuell beräkning av två större parametrar (dvs, maximal tillväxt takt och befolkningstätheten) som representerar tillväxtdynamiken. I jämförelse med traditionella kolonibildande enhet (CFU) analysen, som räknar de celler som odlas i glasrör med tiden på agarplattor, denna metod är mer effektiv och ger mer detaljerad temporal records tillväxt förändringar, men har en strängare detektionsgränsen på låg befolkningstäthet. Sammanfattningsvis är den beskrivna metoden fördelaktiga för exakt och reproducerbar hög genomströmning analys av bakterietillväxt, som kan användas till begreppsmässig slutsatser eller göra teoretiska observationer.
Introduction
Mikrobiologiska undersökningar börjar ofta med kulturen av bakterieceller och bedömningen av bakterietillväxt kurvorna, som utgör ett grundläggande fenomen av bakteriell fysiologi1,2,3. Grundläggande kultur principer är allmänt tillgängliga i publicerad forskningslitteratur och läroböcker eftersom bakterieodling är en grundläggande metodik. På bänk nivå, betydande uppmärksamhet har traditionellt fokuserats på optimera tillväxt medier och odlingsskålar villkor, men kontrollera tillväxttakten, som sannolikt skulle ge ännu större förståelse för mikrobiell fysiologi, har inte varit flitigt studerade4. För exponentiellt växande bakterier, är en viktig parameter i den cellulära staten tillväxttakten, som har rapporterats vara samordnad med den genomet och transkriptom proteomet5,6,7,8 . Kvantitativ utvärdering av bakterietillväxt är alltså avgörande för att förstå mikrobiell fysiologi.
Utvärdera bakterietillväxt, de experimentella metoder som används för att beräkna biomassa är väl etablerad9,10 och baseras på påvisande av biokemiska, fysiska eller biologiska parametrar, till exempel optiska grumlighet. Dessutom är de analysmetoder som används för att fånga de dynamiska egenskaperna hos tillväxt förändringar vanligen baserade på etablerade ickelinjära modeller11,12,13, exempelvis logistiska ekvationer. Tillväxtdynamik förvärvas generellt genom tidsstyrd provtagning av celltillväxt i kultur av antingen mäta optiska grumlighet eller utför kolonibildande enhet (CFU) analyser. Begränsning av dessa metoder för odling och upptäckt är att datapunkterna inte är en sann bild av populationsdynamik eftersom mätning intervallen är ofta i timmar och eftersom villkoret kultur (t.ex.förändringar i temperatur och Luftning) är störd vid tidpunkten för provtagning. Kultur och analystekniker måste uppdateras med senaste tekniska utvecklingen och förståelse. Senaste framstegen inom mikroplattan läsare tillåter realtid observationen av bakterietillväxt och avsevärt minska arbetskostnader. Använda dessa avancerade enheter, har de senaste undersökningarna på bakterietillväxt rapporterat analysmetoder för hög genomströmning mätningar14,15.
Syftet med detta protokoll är att utvärdera den exakta tillväxtdynamiken i en hög genomströmning sätt, vilket kommer att vara värdefullt för kvantitativa studier som slutligen ta itu med frågorna om hur tillväxttakten bestäms och vilka faktorer påverkar tillväxttakten. Protokollet behandlar alla faktorer som bör beaktas för repeterbara och noggrann kvantitering av bakterietillväxt. Den experimentella metoden och analysen beskrivs i detalj i huvudtexten. Denna metod tillåter exakta och reproducerbara analysen av bakterietillväxt på en hög genomströmning sätt. Mikrobiologer kan använda det här protokollet för att härleda ytterligare kvantitativa resultat från deras experimentella bevis. Detta protokoll kan också användas för studier i systembiologi som försöker dra konceptuella slutsatser eller uppnå en teoretisk översikt av tillväxt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet inbegripa förberedelse av en stamaktier av exponentiellt växande celler och replikering av samma proverna i flera brunnar på olika befattningar på mikroplattan. Tidigare startade mikrobiologer kulturen från en övernattning före kultur. Även denna metod kan minska fördröjning av bakterietillväxt, är det svårt att uppnå reproducerbara tillväxtkurvor. Som visas i figur 2, resulterade de oberoende mätningar med gemensamma glycerol bestånden i nästan …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har något att avslöja.
Materials
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| KH2PO4 | Wako | 166-04255 | |
| (NH4)2SO4 | Wako | 019-03435 | |
| MgSO4-7H2O | Wako | 138-00415 | |
| Thiamine-HCl | Wako | 201-00852 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| HCl | Wako | 080-01066 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO4-7H2O) | Wako | 094-01082 | |
| KOH | Wako | 168-21815 | |
| Glycerol | Wako | 075-00611 | |
| Centrifuge tube (50 mL, sterilized) | WATSON | 1342-050S | |
| Pipette Tips, 200 µL | WATSON | 110-705Y | |
| Pipette Tips, 1000 µL | WATSON | 110-8040 | |
| Microtube (1.5 mL) | WATSON | 131-715C | |
| 8 multichannel-pipette | WATSON | NT-8200 | |
| PASORINA STIRRER | AS ONE | 2-4990-02 | |
| Glass cylinder (200 mL) | AS ONE | 1-8562-07 | |
| Precision pH mater | AS ONE | AS800 / 1-054-01 | |
| Pipetman P-200 | GILSON | 1-6855-05 | |
| Pipetman P-1000 | GILSON | 1-6855-06 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (10 mL) | SANPLATEC | SAN27014 | |
| Disposable Serolocical Pipettes (25 mL) | SANPLATEC | SAN27015 | |
| Microtube stand | BM Bio | 801-02Y | |
| Vortex | BM Bio | BM-V1 | |
| Corning Costar 96-well microplate with lid (Flat bottom, Clear) | Sigma-Aldrich | Corning, 3370 | |
| Corning Costar reagent reservoir (50 mL) | Sigma-Aldrich | Corning, 4870 | |
| Stericup GV PVDF (250 mL, 0.22 µM) | Merck Millipore | SCGVU02RE | |
| Pipet-Aid XP | DRUMMOND | 4-000-101 | |
| Bioshaker (BR-23UM MR) | TAITEC | 0053778-000 | |
| Disposal cell (1.5 mL) | Kartell | 1938 / 2-478-02 | |
| DU 730 Life Science UV/Vis Spectrophotometer | Beckman Coulter | A23616 | |
| EPOCH2 | BioTek | 2014-EP2-002 / EPOCH2T | |
| Beaker (500 mL) | IWAKI | 82-0008 | |
| BIO clean bench | Panasonic | MCV-B131F | |
| Glass tubes | NICHIDEN RIKA GLASS | P-10M~P-30 /101019 | |
| Silicone rubber stoppers | ShinEtsu Polymer | T-19 | |
| Bacterial strains | Strain bank organization; National Bio Resource Project (NBRP) in Japan |
References
- Kovarova-Kovar, K., Egli, T. Growth kinetics of suspended microbial cells: from single-substrate-controlled growth to mixed-substrate kinetics. Microbiol Mol Biol Rev. 62 (3), 646-666 (1998).
- Soupene, E., et al. Physiological studies of Escherichia coli strain MG1655: growth defects and apparent cross-regulation of gene expression. J Bacteriol. 185 (18), 5611-5626 (2003).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Egli, T. Microbial growth and physiology: a call for better craftsmanship. Front Microbiol. 6, 287 (2015).
- Kurokawa, M., Seno, S., Matsuda, H., Ying, B. W. Correlation between genome reduction and bacterial growth. DNA Res. 23 (6), 517-525 (2016).
- Matsumoto, Y., Murakami, Y., Tsuru, S., Ying, B. W., Yomo, T. Growth rate-coordinated transcriptome reorganization in bacteria. BMC Genomics. 14, 808 (2013).
- Nahku, R., et al. Specific growth rate dependent transcriptome profiling of Escherichia coli K12 MG1655 in accelerostat cultures. J Biotechnol. 145 (1), 60-65 (2010).
- Dai, X., et al. Reduction of translating ribosomes enables Escherichia coli to maintain elongation rates during slow growth. Nat Microbiol. 2, 16231 (2016).
- Madrid, R. E., Felice, C. J. Microbial biomass estimation. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 97-112 (2005).
- Harris, C. M., Kell, D. B. The estimation of microbial biomass. Biosensors. 1 (1), 17-84 (1985).
- Yates, G. T., Smotzer, T. On the lag phase and initial decline of microbial growth curves. J Theor Biol. 244 (3), 511-517 (2007).
- Kargi, F. Re-interpretation of the logistic equation for batch microbial growth in relation to Monod kinetics. Lett Appl Microbiol. 48 (4), 398-401 (2009).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Crit Rev Food Sci Nutr. 51 (10), 917-945 (2011).
- Sprouffske, K., Wagner, A. Growthcurver: an R package for obtaining interpretable metrics from microbial growth curves. BMC Bioinformatics. 17, 172 (2016).
- Hall, B. G., Acar, H., Nandipati, A., Barlow, M. Growth rates made easy. Mol Biol Evol. 31 (1), 232-238 (2014).
- Hermsen, R., Okano, H., You, C., Werner, N., Hwa, T. A growth-rate composition formula for the growth of E.coli on co-utilized carbon substrates. Mol Syst Biol. 11 (4), 801 (2015).
- Engen, S., Saether, B. E. r- and K-selection in fluctuating populations is determined by the evolutionary trade-off between two fitness measures: Growth rate and lifetime reproductive success. Evolution. 71 (1), 167-173 (2017).
