많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
혈관 불충분 그리고 정상 망막 관류 변경 다양 한 시력을 위협 하 고 안구 질환, 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증 및 녹 내장 등의 병 인에 대 한 주요 요인 중입니다. 따라서 망막 microvascular 준비 중추적인 도구 기본 병 태 생리 기계 장치 윤곽을 그리 다 생리 및 약리 연구 및 질병에 대 한 치료를 디자인 하는. 안과 연구에 마우스 모델의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 망막 혈관 반응성에 대 한 연구는이 종에서 부족. 이 불일치에 대 한 주요 이유는 도전적인 격리 절차는 이러한 망막 혈관의 작은 크기 때문 ~ luminal 직경에서 ≤ 30 µ m. 기능 연구에 대 한 이러한 망막 microvessels의 직접 분리의 문제를 회피, 우리 ex vivo 마우스 망막 vasoactivity 근처 생리 적 조건 하에서 연구를 가능 하 게 절연 및 준비 기술 설립 . 현재 실험 준비 특히 마우스 망막 arterioles를 참조 것입니다, 하지만이 방법은 쉽게 사용할 수 있습니다 microvessels에 쥐에서.
서론
망막 관류에 장애 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증, 녹 내장1,2,3등 다양 한 안구 질환의 병 인에 연루 되었습니다. 따라서, 망막 혈관 반응성을 측정 하기 위한 연구는 이러한 질병의 병 태 생리학을 이해 하는 것이 중요 하 고 접근 새로운 치료를 개발 하.
Murine 게놈에서 유전자 조작의 가능성으로 인해 마우스4심장 혈관 시스템 연구에 대 한 널리 사용 되는 동물 모델 되고있다. 그러나, 망막 혈관 (≤ 30 µ m)의 작은 크기 때문에 측정 마우스 망막 혈관 반응성의 도전 이다. 예를 들어 stereomicroscopic vivo에서 측정을 위한 그들의 광학 해상도 제한 기술과 따라서 ≤ 30 µ m 직경 장비 될 때 보다는 더 적은의 작은 피에 지름 또는 혈액 흐름에 변화를 정확 하 게 탐지를 허용합니다 confocal 현미경 또는 적응 광학 스캔 빛 Ophthalmoscope5,6형광 염료를 사용 하 여 같은 추가 정교한 장치 합니다. 또한, 해석 vivo 측정 지역 식별 목적으로 조직 혈압과 retrobulbar 혈관의 영향 변화 신호 망막 혈관에서 메커니즘 마 취약에 의해 혼동 될 수 있습니다.
따라서, 우리는 ex vivo높은 광학 해상도와 마우스 망막 혈관의 반응을 측정 하는 방법을 개발 했다. 여기에 소개 하는 기술 망막 arterioles 통해 전송 가벼운 현미경 검사 법의 시각화 수 있습니다. 이 메서드를 사용할 수 있는 또한 쥐에, 안구 혈관 연구에서 기술을 대상으로 하는 유전자의 장점에 대 한 액세스를 제공 합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 연구의 실험 절차에 의해는 동물 관리 위원회의 라인란트-Palatinate, 독일 승인 되었다. 동물 보호 안과에서 동물의 사용에 대 한 비전과 안과 (ARVO) 성명에서 연구 및 비전 연구 기관 지침 및 협회에 맞 췄 나. 동물 동물 실험에 대 한 EU 지침 2010/63/EU에 따라 치료 했다. 남성 C57BL/6J 쥐 (The 잭슨 실험실, 바 하버, 나, 미국) 3-4 개월을 세는 실험을 위해 사용 되었다. 동물 표준 조건 (온도 23 ± 2 ° C, 습도 범위 55 ± 10% 및 12 h 명암 주기), 유 숙 했다 그리고 표준 마우스 차 우와 물 광고 libitum에 접근 했다.
1입니다. 마우스 망막의 분리
- 해 부 악기를 준비 테이블에 놓고 모든 악기 가능 빠른 준비 완료 확인 합니다.
- CO2 흡입에 의해 마우스를 희생.
- 스틸가 위 마우스를 목을 벨, 두개골 sagitally가 위의 동일한 쌍을 사용 하 여 두 개의 반쪽으로 잘라 고 피부와 뇌 눈이 위 (그림 1)를 사용 하 여 제거 합니다.
- 눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 떠나 두개골 뼈를 잘라.
- 얼음 처럼 차가운 Krebs Henseleit 버퍼를 포함 하는 해 부 접시에 궤도 전송 합니다.
- 얼음에 해 부 접시를 유지 하거나 변경할 버퍼 마다 10 분.
- 눈이 위를 사용 하 여 궤도 뼈를 잘라내어 눈 지구 궤도 조직 유형 4 정밀 핀셋과 학생 욕실이 봄이 위 (그림 2)를 사용 하 여 함께 제거.
- 부드럽게 Harderian 선, 결합 조직, 그리고 안구 근육 유형 5 정밀 핀셋과 안과 동맥의 주요 분기를 손상 하지 않도록 주의 복용 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 제거 합니다.
- 궤도 안과 동맥의 지점과 결국 10-0 나일론 봉합 (그림 3)를 사용 하 여 안과 동맥의 주요 지점의 인접 끝 선.
- 10 s 사용 하 여 입력 4 정밀 핀셋에 대 한 70% 에탄올을 포함 하는 배양 접시에 눈 세계를 전송 합니다. 해 부 접시에 다시 눈 지구를 놓고 신선한 Krebs 솔루션으로 버퍼를 대체 합니다. 각 막 에탄올 노출 후 약간 흰 나타납니다.
- 주변 막 30 게이지 바늘으로 찔린 고 욕실이 capsulotomy가 위를 사용 하 여 각 막 해 부. 부드럽게 잘라 아이리스 조직, 맥락 막과 망막 사이 욕실이 capsulotomy가 위 한 날카로운 시점 놓고 맥락 막 및 공 막 잘라. (그림 4) 시 신경 주위 scleral 조직 일부를 남겨 주세요.
2. 망막 관류 챔버에 장착
참고: 망막 되 실험을 위해 사용 하는 관류 챔버는 집에서 만든. -및 유출 관 (그림 5)와 함께 투명 한 저수지 그것에 의하여 이루어져 있다. 실리콘 튜브의 한쪽 끝은 histoacryl 접착제와 3 방향 자 지에 연결 된 반대쪽 챔버의 바닥에 붙어 됩니다. 3 방향 자 지에 신선한 Krebs 버퍼를 포함 하는 주사기를 연결 하 고 버퍼와 튜브를 작성.
- 바늘 홀더를 가진 유리 제 micropipette 고 관류 챔버의 하단 튜브의 끝에 그것을 밀어. 다음 100 µ m 직경의 팁을 얻기 위해가 위 종류 4는 micropipette의 팁을 휴식.
- micropipette 끝에 집중 하 고 통해 주사기 튜브에 연결 그것을 플러시. 모 세관 파편에 의해 가려진 하지 주의. 폐색, 경우 그것을 제거 하 고 튜브를 플러시 다른 micropipette 삽입.
- 차가운 Krebs 버퍼 관류 챔버와 스테레오 현미경 챔버를 넣어.
- 관류 챔버에 투명 한 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. 이 플랫폼은 시 신경 및 눈 동맥에 대 한 1.8 m m 폭의 들여쓰기 하 고 1.6 m m 직경의 2 개의 강철 와이어에 배치 됩니다. 다음, 2.8 m m 내경 및 플랫폼에 4.0 m m 외부 직경의 스테인레스 스틸 반지 장소.
- 숟가락을 사용 하 여 주의 해 부 챔버 관류 챔버로 망막 시 신경 및 연결 된 안과 동맥 전송. 이 단계는 가능성을 방지 하기 위해 중요 한 조직의 스트레칭으로 실험에 해로운 수 있습니다.
- 안과 동맥의 근 위 끝의 sutured 부분을, 장소는 micropipette에 10-0 나일론 봉합의 두 미리 형성한 루프 잘라내어는 micropipette와 안과 동맥을 cannulate. Micropipette (그림 6)에 동맥 고 괜 찮 아 요-포인트-핀셋을 사용 하 여 투명 한 플랫폼에 망막을 놓습니다.
- 부드럽게 두 괜 찮 포인트 핀셋으로 앞쪽 렌즈 capsula을 열고 눈물, 렌즈를 꺼내와 microscissors를 사용 하 여 전체 렌즈 capsula를 잘라.
- 그 후, 망막 시 신경에 동위 플에서 절반 거리에 4 개의 방사형 절 개를 확인 하 고 바닥에 그것을 해결 하기 위해 망막에는 스테인레스 스틸 반지를 배치. 망막은 이제 실험 (그림 7)에 대 한 준비.
3. 실험에 대 한 망막 Arterioles의 준비
- 가벼운 현미경 관류 챔버를 놓습니다. 목표는 100 X 물 침수 렌즈입니다.
- Pericyclic 펌프는 두 개의 튜브에 대 한에-및 아웃-flow를 연결 하 고 95% O2 산소 하 고 37 ° c.에 5% CO2 탄산 Krebs 버퍼와 챔버를 순환 100 사이 120 mL/min 유량을 사용 합니다.
- 저수지 실리콘 호스를 통해 3 방향 자 지에는 micropipette에 연결 된 실리콘 튜브를 연결 합니다. 그런 다음 Krebs 버퍼 높이 50 mm Hg에 해당 하는 저수지를 채울 하지만 3 방향 자 지 아직 열지 마십시오.
- 현미경과 망막 표면에 초점의 목표 통해 보세요. 혈관 또는 붉은 혈액 세포에 대 한 검색. 혈관은 완전히 붕괴, 그래서 때로는 일부 붉은 혈액 세포를 볼 수 있습니다만 가능 하다.
- 혈관 발견 되 면 그것에 집중 하 고 3 방향 자 지를 엽니다. 혈관의 직경은 즉시 증가 해야 하 고 붉은 혈액 세포 이동 중 배, 한 되는 경우 또는 centripetally는 venule 경우. arterioles 직경 venules의 순서에 비해 작은 수 있습니다.
- 잘 보이는 벽 혈관 발견 되 면 그것은 30 분 (그림 8)의 재래식 기간 뒤 실험에 대 한 사용할 수 있습니다. 재래식 기간 동안는 arterioles 결과 luminal 직경 감소 10% 미만에 약한 내장 음색을 개발 합니다.
4. 실험 수행
- 목욕 솔루션에 추가 하 여는 thromboxane 모방 9,11-미치기-9α, 11α methanoepoxy 스타 글란 딘 F2α (U46619)와 혈관의 생존 능력을 테스트 합니다. 이 에이전트는 ≥ 10의 농도에서 휴식 하는 직경에서 약 50% 마우스 망막 arterioles 수축-6 M.
- 일단 그릇은 가능한 확인, 순환 펌프에 의해 목욕에서 길 항 제를 세척 하 고 목욕으로 신선한 Krebs 버퍼를 공급.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
U-46619 농도-종속 vasoconstrictor 응답 망막 arterioles 야생-타입 마우스 C57Bl/6J 배경에서 생산. 10-6 M의 농도에서 luminal 직경에서 감소는 휴식 직경에서 ≈50 %를 했다. 그림 9A 한 망막 되의 대표적인 농도-응답 곡선을 보여 줍니다. U46619와 preconstricted arterioles에 아 세 틸 콜린의 누적 관리 갖는 luminal 직경 농도 의존 증가 ≈25 %를 10-5 M, 그대로 혈관 내 피 (지표에 preconstricted 직경에서 그림 9B)입니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
마우스 망막에 혈관 반응의 측정은 망막 혈관의 작은 크기 때문에 도전 이다. 제시 기법으로 망막 arterioles 전송된 가벼운 현미경 검사 법에 의해 시각화 됩니다. 이 격리 된 망막은 반투명 하기 때문에 가능 하다. 기술의 장점은 높은 광학 해상도입니다. 계산된 공간 해상도 11 픽셀 / µ m 이다. 그러나, 하얀 빛을 사용 하 여이 광 시스템에 대 한 실제 해상도 Abbe 회절 한계에 의해 설명 된다 200, 300 nm 사이입니다. 마우스 망막 arterioles의 첫 번째 분기에는 20 ~ 30 μ m의 내부 직경, 이후 약 1%의 직경 변화가이 시스템으로 알 수 있습니다. 작은 망막 arterioles5,,67시각화에 추가 기술 장치 또는 다른 연구에서 보고 형광 염료의 필요가 있다. 기술의 단점은 훈련 된 수 사관 90 ~ 120 분 사이 긴 준비...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.
감사의 글
이 작품은 도이치 Ophthalmologische 분야 (개)와 에른스트 und Berta Grimmke 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 강철 가위 | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| 눈 가위 | Geuder | G-19390 | 1x 스트레이트, 10.5cm |
| 정밀 핀셋, 가는 팁이 있는 스트레이트 | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x 타입 4 |
| 정밀 핀셋, 엑스트라 파인 팁이 있는 스트레이트 | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x 타입 5 |
| Vannas 캡슐 절개술 가위 | Geuder | 19760 | 1x 직선, 77mm |
| 학생 Vannas 스프링 가위 | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x 곡선, |
| Barraquer< / em> 바늘 홀더 | Geuder | G-17500 | 1x 곡선, 120mm |
| 바늘 | Becton, Dickinson and Company | 305128 1x 30G | |
| 유리 모세 필라리 (마이크로 피펫 생산 용) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm, 외경/내경) |
| 나일론 봉합 | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon 세포 배양 접시 | Thermo Fisher Scientific | 153066 1x 35 mm 직경 | |
| Nunclon 세포 배양 접시 | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm 직경 |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl 접착제 | B. 브라운 외과, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| >Equipment | |||
| Pericyclic pump (싸이클로 II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| 수직 피펫 풀러 모델 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| 현미경(Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| 침수 대물렌즈 LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| 디지털 카메라(TK-C1381) | JVC | 1x | |
| 관류 챔버 | 자체 제작 | 1배 | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| > | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| 염화칼슘 이수화물(CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| 염화칼륨 (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| 인산이수소칼륨 (KH2PO4) | Carl Roth | GmbH 3904.2 | |
| 황산마그네슘 (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| 염화나트륨 (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| 탄산 수소 나트륨 (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- 포도당 일수화물 | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | 케이맨 화학 | 16450 | |
| 아세틸 콜린 클로라이드 | 시그마 Aldrich | A6625-25G |
참고문헌
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
