Questo video mostra una procedura per la generazione di culture neuronali dall'embrione fine e l'inizio della corteccia del mouse postnatale. Queste culture possono essere utilizzati per immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, calcio e sodio di imaging e di fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione genetica postnatale letale.
Abstract
Questo video vi guiderà attraverso il processo per la generazione di neuroni corticali culture dall'embrione fine e l'inizio del cervello di topo postnatale. Queste culture può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, imaging di calcio e sodio, proteine e / o RNA isolamento. Queste culture anche fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione in ritardo embrionale o postnatale gene letale. La procedura è relativamente semplice, richiede una certa esperienza nelle tecniche di coltura e non dovrebbe richiedere più di due o tre ore se si è adeguatamente preparati. Un'attenta separazione della crosta corticale dal talamo-corticale del tratto di fibra ridurrà il numero degli indesiderati cellule non neuronali. Per aumentare la resa delle cellule neuronali triturare i pezzi del tessuto corticale delicatamente dopo la fase di incubazione dell'enzima. Questo è indispensabile in quanto previene inutili danni alle cellule e la morte prematura delle cellule neuronali. Dato che queste colture sono mantenute in assenza di cellule di alimentazione glia, offrono anche un vantaggio aggiunto di culture crescente arricchito nei neuroni.
Protocol
I preparativi prima del giorno di coltura: Preparare soluzione sterile dissezione (DS). Preparare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con supplementi di B27). Autoclave DDH 2 O e sterilizzare coversilps vetro, se necessario. Cappotto tessuto piatti cultura o coprioggetto di vetro con poli-D-lisina. Poli-D-lisina Coating: Preparare il giorno prima della coltura in condizioni di sterilità. Aliquota del disg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!