Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical
Summary
Este vídeo mostra um procedimento para a geração de culturas de neurônios a partir de embrião tarde e córtex do rato pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados para imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, cálcio e sódio de imagem e fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética pós-natal letal.
Abstract
Este vídeo irá guiá-lo através do processo de geração de culturas cortical neuronal de embriões tarde e cérebro de camundongos pós-natal precoce. Essas culturas podem ser usados para uma variedade de aplicações, incluindo imunocitoquímica, bioquímica, eletrofisiologia, imageamento de cálcio e sódio, proteína e / ou RNA isolamento. Estas culturas também fornecer uma plataforma para estudar o desenvolvimento neuronal de animais transgênicos que carregam uma mutação genética tarde embrionárias ou pós-natal letal. O procedimento é relativamente simples, requer alguma experiência na técnica de cultura de tecidos e não deve demorar mais do que 2-3 horas, se você estiver devidamente preparado. Uma separação cuidadosa da casca cortical do trato fibras tálamo-cortical vai reduzir o número de gravidezes indesejadas células não-neuronais. Para aumentar a produção de células neuronais triturar os pedaços do tecido cortical delicadamente após a etapa de incubação enzimática. Isto é imperativo, uma vez que evita lesões desnecessárias para as células e prematura morte celular neuronal. Uma vez que estas culturas são mantidos na ausência de células alimentadoras glia, eles também oferecem uma vantagem adicional de culturas em crescimento enriquecido em neurônios.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma | F0503 | ||
| Sodium Chloride | Sigma | S9625 | ||
| Vibraslicer | Campden Instruments Ltd. | |||
| Potassim Chloride | Sigma | P4504 | ||
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S0876 | ||
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5379 | ||
| Hepes | Sigma | H3375 | ||
| D (+)-Glucose | Sigma | G8270 | ||
| Sucrose | Sigma | S0389 | ||
| Poly-D-Lysine | Sigma | P7280 | ||
| B27 Supplement | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Neurobasal Media (NBM) | Invirtogen (Gibco) | 21103-049 | ||
| 2-Amino-5-phosphonopentanoic acid | Sigma | A5282 | ||
| Bovine Albumin | Sigma | A7030 | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T9253 | ||
| Sodium Hydroxide, 1N solution | Fisher | SS266-1 | ||
| L-Cysteine | Sigma | C7755 | ||
| Bacto Agar | Difco | 0140-01 | ||
| Papain | Worthington | LS 03126 | ||
| Sterile 0.2 µm Syringe Filter | Fisher | DDA02025S0 | ||
| Glass Coverslips, No1, Ø12mm | Bellco Glass Inc. | 1943-00012 | ||
| Minimum Essential Media (MEM) | Invitrogen (Gibco) | 11090-081 | with Earle’s salts without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15070-063 | for non-neuronal culture | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen (Gibco) | 16140-071 | needed for non-neuronal cultures | |
| Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle | Fisher | 12-565-25 | Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead. | |
| Glass bottom “Imaging dishes” | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive! |
