Это видео показывает процедуру для создания нейронных культур с конца эмбриона и раннего послеродового коры мыши. Эти культуры могут быть использованы для иммуноцитохимии, биохимии, электрофизиологии, кальция и натрия изображений и обеспечить платформу для изучения нейронных развития трансгенных животных, которые несут послеродового летальная мутация гена.
Abstract
Это видео поможет вам процесс создания корковых нейронов культур с конца эмбриона и раннего постнатального мозга мыши. Эти культуры могут быть использованы для разнообразных приложений, включая иммуноцитохимии, биохимии, электрофизиологии, кальция и натрия с изображениями, белка и / или РНК изоляции. Эти культуры также предоставляют платформу для изучения нейронных развития трансгенных животных, которые несут конце эмбриона или послеродового летальная мутация гена. Процедура сравнительно простой, требует некоторого опыта в ткани культуры и техники не должно занять больше времени, чем два-три часа, если вы должным образом подготовлены. Тщательное разделение корковых кожуру от таламо-корковые волокна тракта позволит сократить количество нежелательных без нервных клеток. Чтобы повысить урожайность нервных клеток растирают кусков корковой ткани мягко после шага инкубации фермента. Это необходимо, так как предотвращает ненужное повреждение клеток и преждевременной гибели нейронов клетки. С этих культур ведутся в отсутствие клеток глии подачи, они также предлагают дополнительное преимущество растущих культур обогащенные нейронами.
Protocol
Подготовка до дня культивирования: Подготовка стерильного рассекает решение (DS). Подготовка NBM/B27 (Neurobasal Mediom с B27 добавки). Автоклав DDH 2 O и стерилизовать стеклянные coversilps, если нужно. Пальто культуры тканей посуду или стеклянные покровные с поли-D-лизина. <p …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!