JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
유전학

Laser Microirradiation at studere In Vivo cellulære svar til Simple og komplekse DNA-skader

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56213
, , , , , ,
1Department of Biological Chemistry, School of Medicine,University of California, Irvine, 2Beckman Laser Institute and Medical Clinic,University of California, Irvine, 3Department of Developmental and Cell Biology, School of Biological Sciences,University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering and Surgery,University of California, Irvine

Summary

Målet med denne protokol er at beskrive, hvordan du bruger laser microirradiation til at fremkalde forskellige typer af DNA-skader, herunder relativt simple strand pauser og komplekse skader, at studere DNA skader signalering og reparation faktor forsamling på skade steder in vivo .

Abstract

DNA-skader inducerer specifikke signalering og reparation reaktioner i cellen, som er afgørende for beskyttelsen af genom integritet. Laser microirradiation blev en værdifuld eksperimentelle redskab til at undersøge DNA skader svar (DDR) i vivo. Det giver mulighed for real-time høj opløsning encellede analyse af makromolekylære dynamics svar til laser-induceret skade er begrænset til en submicrometer region i cellekernen. Men forskellige laser betingelser har været brugt uden påskønnelse af forskelle i typer af skader induceret. Som følge heraf arten af skaderne er ofte ikke godt karakteriseret eller kontrolleret, forårsager tilsyneladende inkonsistens i ansættelse eller ændring af profiler. Vi viste, at forskellige bestråling betingelser (dvs., forskellige bølgelængder samt forskellige input beføjelser (irradiances) af en femtosekund (fs) nær-infrarødt (NIR) laser) induceret særskilte DDR og reparation protein forsamlinger. Dette afspejler typen af DNA skade produceret. Denne protokol beskriver hvordan titrering af laser effektoptag tillader induktion af forskellige beløb og kompleksiteten af DNA-skader, som kan nemt overvåges af påvisning af base og crosslinking skader, differential poly (ADP-ribose) (PARI) signalering, og pathway-specifikke reparation faktor forsamlinger på skade steder. Når skader betingelser bestemmes, er det muligt at undersøge virkningerne af forskellige skader kompleksitet og differentieret skader signalering og udtynding af upstream faktorer på enhver faktor af interesse.

Introduction

In Vivo DNA skader signalering er ikke velbeskrevet
In vivo, DNA er kompleksbundet med histoner og andre faktorer til form kromatin fibre. Regulering af kromatin struktur er af afgørende betydning for DNA stofskifte. For eksempel er Histon variant H2AX fosforyleret af ataksi-telangiectasia muteret (ATM) og andre kinaser følgende dobbelt-strenget pauser (DSB) induktion, og er vigtig for DSB skader signal forstærkning samt give en docking-site for andre faktorer. Spredning af skader signalering og reparation pathway valg synes at være kritisk påvirket af lokale kromatin struktur på skade steder1. En række kromatin remodeling faktorer, Histon chaperoneproteiner og Histon ændre enzymer er faktisk ansat til at skade websteder og er vigtige for effektiv DNA reparation, fremhæver betydningen af kromatin forordning i DDR og reparere2 , 3 , 4. Desuden skade site klynger eller repositionering blev observeret i gær og drosophila5,6,7,8, der minder om relocalization af genet loci i de subnuclear rum forbundet med gen forordning9,10. Nylige undersøgelser i mus og humane celler viste også mobilisering af DSB websteder, hvilke påvirkninger reparere troskab og pathway valg11,12. Dette øger muligheden for, at DDR/reparation kan også være tæt knyttet til nukleare arkitektur, højere-ordens kromatin organisation og kromosom dynamics i cellekernen. Det er således afgørende for at udvikle høj opløsning metoder til at studere DDR og reparation processer i forbindelse med den endogene nukleare miljø i en levende celle for at forstå kort – og langsigtede konsekvenser af DNA-skader.

Afgørende rolle for PAR Polymerase (PARP) i måle omfanget og typen af skader og regulere Protein forsamling på webstedet skader
PARP1 er et DNA nick sensor hurtigt aktiveres af DNA-skader, der spiller en afgørende rolle i DNA reparation13. PARP1 var oprindeligt tænkt til at fungere sammen med X-Ray reparation Cross supplerer 1 (XRCC1) til at fremme base excision reparation (BER), men nylige undersøgelser afslører sin rolle i andre DNA reparation veje, herunder DSB reparation14. Aktiveret PARP1 bruger nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD+) som substrat til ADP-ribosylate flere mål proteiner, herunder sig selv. Dette enzym og andre medlemmer af familien har tiltrukket stor opmærksomhed i de seneste år, som PARP hæmmere er dukket op som lovende terapeutiske lægemidler til kræft. Selvom PARP hæmmere blev oprindeligt fundet for at være effektiv i brystkræftgen (BRCA)-muteret brystkræftceller, der er nu en overflod af beviser for deres effekter i mono- og kombination behandlinger sammen med DNA skader agenter/bestråling mod et bredt spektrum af kræftformer med mutationer ikke begrænset til BRCA15,16,17,18,19,20.

På det molekylære niveau, var PARP aktivering vist at spille en kritisk rolle i at organisere lokale kromatin struktur på skade steder. PARI-afhængige rekruttering af kromatin ændring enzymer letter DSB reparation og dikterer reparere pathway valg, foreslår vigtige stilladser rolle PAR ændring på skade steder. 13,21,22,23,24,25,26,27,28,29, 30,31 vi for nylig viste udelukkelse af p53-bindende protein 1 (53BP1) fra skader websteder af PAR 32, giver en alternativ forklaring for 53BP1-afhængige hyperactivation af () ikke-homologe endjoining NHEJ) af PARP inhibitor og fremhæve betydningen af PARP i DSB reparation pathway valg33,34. PARP1 også faktorer direkte PARylates og påvirker aktiviteten af flere DNA reparation14.

Ved hjælp af Laser Microirradiation som et redskab til at studere DDR/reparation In Vivo
Laser microirradiation til at producere sub micron ændringer på individuelle kromosomer blev først beskrevet i 196935 og gennemgået i detaljer i 198136. Flere årtier senere, laser microirradiation blev vist sig at fremkalde DNA skader på en defineret submicrometer region i cellekernen, og var vist sig for at være en værdifuld teknik til at studere ansættelse eller ændring af forskellige faktorer til DNA læsioner in vivo 13 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41. denne metode giver mulighed for påvisning af de faktorer, som ikke udgør særskilte bestråling-induceret foci (IRIF) på skade steder39,42. Det er også muligt at undersøge den spatiotemporelle dynamics af kromatin strukturelle ændringer både på skade steder og i resten af kernen. Vi omhyggeligt sammenlignet DDRs induceret af forskellige lasersystemer og input beføjelser til at vurdere forholdet mellem typen af DNA-skader og microirradiation betingelser32,43,44, 45. Afvigende rekruttering mønstre af 53BP1 og telomeric gentage bindende faktor 2 (TRF2) blev observeret i de tidligere laser skade undersøgelser, som dannede grundlag for den tilbagevendende bekymring for den “ikke-fysiologiske” karakter af laser-induceret skade46 ,47,48,49. Vi fandt, at disse tilsyneladende uoverensstemmelser nu kunne forklares med differentieret PARP signalering, som måler mængden og kompleksiteten af inducerede skader32. Vi har bekræftet, at: 1) laser-microirradiated celler (selv efter høje input-power bestråling) er anholdt i interfase i en skade checkpoint kontrol-afhængige måde og forblive levedygtige (mindst op til 48 h)32,50; og 2) reparation faktor rekruttering/ændringer trofast sammenfatte dem observeret med behandling med konventionelle DNA skadelige agenser og DSB induktion af endonucleases32,39,42, 44,50,51,52. Disse resultater støtter kraftigt den fysiologiske relevansen af at studere laser skade-induceret cellulære svar.

Protocol

1. grundlæggende celle forberedelse Bemærk: Dette trin er for standard immunofluorescens påvisning af endogene protein ansættelse eller ændring, og for brugen af en cellelinje stabilt udtrykker en fluorescently mærkede rekombinante proteiner. For eksempel, undersøgelse Potorustridactylus (PtK2) pungdyr nyre epitelceller stabilt udtryk for EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP blev brugt i vores tidligere (figur 1)32. I…

Representative Results

Ved hjælp af PtK2 celler stabilt udtryk for EGFP-53BP11220-1711 eller TRF2-YFP, laser effektoptag titreringen blev foretaget til at bestemme den optimale betingelse for deres ansættelse (figur 1)32. På høje input-power laser skade steder, den betydelige klynger af CPD (crosslinking skader typisk genereres af ultraviolet (UV) skader) samt normal god landbrugspraksis-NTH1 DNA glycosylase, som specifikt genkender base skader ble…

Discussion

Fordelene ved at bruge laser microirradiation til DDR forskning er:

1. det er muligt at fremkalde forskellige typer og mængder af DNA skade fra simple strand pauser til komplekse DNA-skader, og for at opdage forskellige reparation faktorer på DNA skader websteder ved at justere parametrene laser bestråling. Det er også muligt at påføre skade flere gange i den samme cellekerne for at evaluere trans effekter (som i figur 3).

<p class="jove_content…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. Akira Yasui ved Tohoku Universitet, Japan for normal god landbrugspraksis-NTH1 udtryk plasmid, og Dr. Eros Lazzerini Denchi på Scripps Research Institute, La Jolla, Californien for TRF2-YFP og EGFP-53BP11220-1711 udtryk plasmider. Dette arbejde blev støttet af Air Force Office for videnskabelig forskning (FA9550-04-1-0101) og Beckman Laser Institute Inc. Foundation (til M.W.B), Ford Foundation stipendium fra National Academy of Sciences (til B.A.S), og NSF MCB-1615701 og CRCC CRR-17-426665 (til K. Y.).

Materials

Ti:Sapphire NIR pulsed femtosecond laser Mira-900 Coherent Inc. Mira 900
Inverted microscope  Carl Zeiss Axiovert 200M
63X/1.4 NA objective Zeiss APOCHROMAT Ph3 
Compact Rotation Stage  Newport Corp PR50PP
Temperature Controller Warner TC-344B
Heating System Ibidi  10918
Gas Incubation System Ibidi  11920
Laser Power and Energy Meter (RoHS) Coherent FieldMaxII-TOP 
ORCA-R2 Digital CCD Camera Hamamatsu C10600
LSM 510 META Laser Scanning Microscopes Carl Zeiss
100X/1.3 NA Zeiss Plan APO Carl Zeiss
35mm Gridded Dishes  MatTek P35G-1.5-14-CGRD-D
PtK2 kidney epithelial cells ATCC CCL 56 
HeLa cells ATCC CCL-2
DMEM Life Technologies 11885-092
CO2-Independent Medium  Life Technologies 18045-088
Advanced MEM  Life Technologies 12492-013 supplemented with L-Glutamine, 4% FBS
penicillin/streptomycin Fisher Scientific 15140122
L-Glutamine Fisher Scientific 25030081
FBS Omega Scientific FB-02
Thymidine   SIGMA T9250
serum free media     (Opti-MEM I Reduced Serum Media) Fisher Scientific 11058021
Anti-Cycolbutance pyrimidine dimer (CPD) (mouse) Kamiya Biomedical Company MC-062
Anti-XRCC1 (mouse ) Gene Tex Inc GTX72311
Anti-53BP1 (rabbit) Santa Cruz Biotech sc-22760
Anti-CtIP (rabbit) Abcam ab70163
Anti-PAR polymers (mouse) Enzo Life Sciences BML-SA216-0100
Anti-PAR (rabbit) Trevigen 4336-BPC-100
Anti-TRF2 (mouse) Novus Biological  NB100-56506
Anti 6-4PP (mouse) Kamiya Biomedical
Anti-Rad21 (Rabbit)                     (for cohesin detection) generated in Yokomori (KY) lab
Anti-Rad51 (Rabbit) Santa Cruz Biotechnology SC-8349
Anti-Ku70 (mouse)  Novus Biologicals NB100-102
8-oxiguanine  Trevigen, Inc.
Anti-PARP1  (Rabbit)                     generated in KY lab ref 43
 Anti-hCAPG (Rabbit)                    (for condensin detection) generated in KY lab ref 42
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG  Jackson ImmunoResearch Inc 711-165-152
Donkey Anti-Mouse Alexa Fluor 488 IgG Thermo Fisher Scientific A-21202
HiPerFect siRNA Transfection Reagent Qiagen 301705
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific 11668019
GFP-SMC1 stable cell line     generated in KY lab ref 49 
GFP-NEIL2 stable cell line generated in KY lab ref 54
GFP-NTH1 stable cell line generated in KY lab ref 32
GFP-SMC1 plasmid generated in KY lab
GFP-Ku plasmid generated in KY lab
Anti-MDC1 (rabbit)  Novus Biologicals NB100–395
Anti-gH2AX (rabbit)  Millipore 07–164
EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
TRF2-YFP PtK2 stable cell line generated in Berns lab ref 32
DMSO Sigma D2650-100ML
PARG inhibitor Trevigen 4680-096-03
DNA–PKcs inhibitor  NU7026  Sigma N1537
ATM inhibitor KU55933  Calbiochem 118500
Olaparib  Apexbio Technology A4154
Paraformaldehyde  ELECTRON MICROSCOPY SCIENC MS 100503-916 (EA)
Quantity One 1-D Analysis Software Version 4.6.9 Bio-Rad SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC  image analysis program
Excel microsoft spreadsheet program
Triton X100 Fisher Scientific BP151-500 detergent
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 10X without calcium and magnesium Fisher Scientific 14200166 dilute to 1X 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altmeyer, M., Lukas, J. To spread or not to spread–chromatin modifications in response to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 23 (2), 156-165 (2013).
  2. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  3. Misteli, T., Soutoglou, E. The emerging role of nuclear architecture in DNA repair and genome maintenance. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 10 (4), 243-254 (2009).
  4. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).
  5. Chiolo, I., et al. Double-strand breaks in heterochromatin move outside of a dynamic HP1a domain to complete recombinational repair. Cell. 144 (5), 732-744 (2011).
  6. Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre. Nat. Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).
  7. Ryu, T., et al. Heterochromatic breaks move to the nuclear periphery to continue recombinational repair. Nat. Cell Biol. 17 (11), 1401-1411 (2015).
  8. Torres-Rosell, J., et al. The Smc5-Smc6 complex and SUMO modification of Rad52 regulates recombinational repair at the ribosomal gene locus. Nat. Cell Biol. 9 (8), 923-931 (2007).
  9. Chakalova, L., Debrand, E., Mitchell, J. A., Osborne, C. S., Fraser, P. Replication and transcription: Shaping the landscape of the genome. Nat. Rev. Genet. 6 (9), 669-678 (2005).
  10. Schoenfelder, S., et al. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat. Genet. 42 (1), 53-61 (2010).
  11. Gelot, C., et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol. Cell. 61 (1), 15-26 (2015).
  12. Lottersberger, F., Karssemeijer, R. A., Dimitrova, N., de Lange, T. 53BP1 and the LINC Complex Promote Microtubule-Dependent DSB Mobility and DNA Repair. Cell. 163 (4), 880-893 (2015).
  13. Ball, A. R., Yokomori, K. Damage site chromatin: open or closed?. Curr. Opin. Cell Biol. 23 (3), 277-283 (2011).
  14. Beck, C., Robert, I., Reina-San-Martin, B., Schreiber, V., Dantzer, F. Poly(ADP-ribose) polymerases in double-strand break repair: Focus on PARP1, PARP2 and PARP3. Exp. Cell Res. 329 (1), 18-25 (2014).
  15. Basu, B., Sandhu, S. K., de Bono, J. S. PARP inhibitors: mechanism of action and their potential role in the prevention and treatment of cancer. Drugs. 72 (12), 1579-1590 (2012).
  16. Deeks, E. D. Olaparib: first global approval. Drugs. 75 (2), 231-240 (2015).
  17. Sonnenblick, A., de Azambuja, E., Azim, H. A., Piccart, M. An update on PARP inhibitors–moving to the adjuvant setting. Nat. Rev. Clin. Oncol. 12 (1), 27-41 (2015).
  18. Garber, K. PARP inhibitors bounce back. Nat. Rev. Drug Discov. 12 (10), 725-727 (2013).
  19. Lord, C. J., Tutt, A. N., Ashworth, A. Synthetic lethality and cancer therapy: lessons learned from the development of PARP inhibitors. Annu. Rev. Med. 66, 455-470 (2015).
  20. Feng, F. Y., de Bono, J. S., Rubin, M. A., Knudsen, K. E. Chromatin to Clinic: The Molecular Rationale for PARP1 Inhibitor Function. Mol. Cell. 58 (6), 925-934 (2015).
  21. Patel, A. G., Sarkaria, J. N., Kaufmann, S. H. Nonhomologous end joining drives poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor lethality in homologous recombination-deficient cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (8), 3406-3411 (2011).
  22. Ahel, D., et al. Poly(ADP-ribose)-dependent regulation of DNA repair by the chromatin remodeling enzyme ALC1. Science. 325 (5945), 1240-1243 (2009).
  23. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (33), 13770-13774 (2009).
  24. Sun, Y., et al. Histone H3 methylation links DNA damage detection to activation of the tumour suppressor Tip60. Nat. Cell Biol. 11 (11), 1376-1382 (2009).
  25. Ayrapetov, M. K., Gursoy-Yuzugullu, O., Xu, C., Xu, Y., Price, B. D. DNA double-strand breaks promote methylation of histone H3 on lysine 9 and transient formation of repressive chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (25), 9169-9174 (2014).
  26. Khoury-Haddad, H., et al. PARP1-dependent recruitment of KDM4D histone demethylase to DNA damage sites promotes double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (7), E728-E737 (2014).
  27. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  28. Larsen, D. H., et al. The chromatin-remodeling factor CHD4 coordinates signaling and repair after DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 731-740 (2010).
  29. Polo, S. E., Kaidi, A., Baskcomb, L., Galanty, Y., Jackson, S. P. Regulation of DNA-damage responses and cell-cycle progression by the chromatin remodelling factor CHD4. EMBO J. 29 (18), 3130-3139 (2010).
  30. Smeenk, G., et al. The NuRD chromatin-remodeling complex regulates signaling and repair of DNA damage. J. Cell Biol. 190 (5), 741-749 (2010).
  31. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Rep. 11 (9), 1486-1500 (2015).
  32. Saquilabon Cruz, G. M., et al. Femtosecond near-infrared laser microirradiation reveals a crucial role for PARP signaling on factor assemblies at DNA damage sites. Nuc. Acids Res. 44 (3), e27 (2015).
  33. Bouwman, P., et al. 53BP1 loss rescues BRCA1 deficiency and is associated with triple-negative and BRCA-mutated breast cancers. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (6), 688-695 (2010).
  34. Jaspers, J. E., et al. Loss of 53BP1 causes PARP inhibitor resistance in Brca1-mutated mouse mammary tumors. Cancer Discov. 3 (1), 68-81 (2013).
  35. Berns, M. W., Olson, R. S., Rounds, D. E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam. Nature. 221 (5175), 74-75 (1969).
  36. Berns, M. W., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213 (4507), 505-513 (1981).
  37. Botchway, S. W., Reynolds, P., Parker, A. W., O’Neill, P. Laser-induced radiation microbeam technology and simultaneous real-time fluorescence imaging in live cells. Methods Enzymol. 504, 3-28 (2012).
  38. Ferrando-May, E., et al. Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling. Front Genet. 4, 135 (2013).
  39. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 37 (9), e68 (2009).
  40. Kruhlak, M. J., Celeste, A., Nussenzweig, A. Monitoring DNA breaks in optically highlighted chromatin in living cells by laser scanning confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 523, 125-140 (2009).
  41. Walter, J., Cremer, T., Miyagawa, K., Tashiro, S. A new system for laser-UVA-microirradiation of living cells. J. Microsc. 209 (2), 71-75 (2003).
  42. Kim, J. S., et al. In situ analysis of DNA damage response and repair using laser microirradiation. Methods Cell Biol. 82, 377-407 (2007).
  43. Kim, J. S., Krasieva, T. B., LaMorte, V. J., Taylor, A. M. R., Yokomori, K. Specific recruitment of human cohesin to laser-induced DNA damage. J. Biol. Chem. 277 (47), 45149-45153 (2002).
  44. Kong, X., et al. Condensin I Recruitment to Base Damage-Enriched DNA Lesions Is Modulated by PARP1. PLoS One. 6 (8), e23548 (2011).
  45. Heale, J. T., et al. Condensin I interacts with the PARP-1-XRCC1 complex and functions in DNA single-stranded break repair. Mol. Cell. 21 (6), 837-848 (2006).
  46. Bradshaw, P. S., Stavropoulos, D. J., Meyn, M. S. Human telomeric protein TRF2 associates with genomic double-strand breaks as an early response to DNA damage. Nat. Genet. 37 (2), 193-197 (2005).
  47. Huda, N., et al. Recruitment of TRF2 to laser-induced DNA damage sites. Free Radic. Biol. Med. 53 (5), 1192-1197 (2012).
  48. Williams, E. S., et al. DNA double-strand breaks are not sufficient to initiate recruitment of TRF2. Nat. Genet. 39, 696-698 (2007).
  49. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. J. Cell Biol. 173 (2), 195-206 (2006).
  50. Kim, J. S., et al. Independent and sequential recruitment of NHEJ and HR factors to DNA damage sites in mammalian cells. J. Cell Biol. 170 (3), 341-347 (2005).
  51. Kong, X., et al. Distinct functions of human cohesin-SA1 and cohesin-SA2 in double-strand break repair. Mol. Cell Biol. 34 (4), 685-698 (2014).
  52. Wu, N., et al. Scc1 sumoylation by Mms21 promotes sister chromatid recombination through counteracting Wapl. Genes Dev. 26 (13), 1473-1485 (2012).
  53. Fradet-Turcotte, A., et al. 53BP1 is a reader of the DNA-damage-induced H2A Lys 15 ubiquitin mark. Nature. 499, 50-54 (2013).
  54. Pryde, F., et al. 53BP1 exchanges slowly at the sites of DNA damage and appears to require RNA for its association with chromatin. J. Cell Sci. 118, 2043-2055 (2005).
  55. Zgheib, O., Pataky, K., Brugger, J., Halazonetis, T. D. An oligomerized 53BP1 tudor domain suffices for recognition of DNA double-strand breaks. Mol. Cell. Biol. 29, 1050-1058 (2009).
  56. Lan, L., et al. In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (38), 13738-13743 (2004).
  57. Hinde, E., Kong, X., Yokomori, K., Gratton, E. Chromatin dynamics during DNA repair revealed by pair correlation analysis of molecular flow in the nucleus. Biophys. J. 107 (1), 55-65 (2014).
  58. Silva, B. A., Stambaugh, J. R., Yokomori, K., Shah, J. V., Berns, M. W. DNA damage to a single chromosome end delays anaphase onset. J. Biol. Chem. 289 (33), 22771-22784 (2014).
  59. Hinde, E., Yokomori, K., Gaus, K., Hahn, K. M., Gratton, E. Fluctuation-based imaging of nuclear Rac1 activation by protein oligomerisation. Sci. Rep. 4, 4219 (2014).
  60. Meyer, B., et al. Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK. Nuc. Acids Res. 41 (12), 6109-6118 (2013).
  61. Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146 (5), 905-915 (1999).
  62. Kurose, A., Tanaka, T., Huang, X., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Synchronization in the cell cycle by inhibitors of DNA replication induces histone H2AX phosphorylation: an indication of DNA damage. Cell Prolif. 39 (3), 231-240 (2006).
  63. Huang, X., Tanaka, T., Kurose, A., Traganos, F., Darzynkiewicz, Z. Constitutive histone H2AX phosphorylation on Ser-139 in cells untreated by genotoxic agents is cell-cycle phase specific and attenuated by scavenging reactive oxygen species. Int. J. Oncol. 29 (2), 495-501 (2006).
  64. MacPhail, S. H., Banáth, J. P., Yu, Y., Chu, E., Olive, P. L. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiat. Res. 159 (6), 759-767 (2003).
  65. Aymard, F., et al. Transcriptionally active chromatin recruits homologous recombination at DNA double-strand breaks. Nat. Struc. Mol. Biol. 21 (4), 366-374 (2014).
  66. Berkovich, E., Monnat, R. J. J., Kastan, M. B. Roles of ATM and NBS1 in chromatin structure modulation and DNA double-strand break repair. Nat. Cell Biol. 9 (6), 683-690 (2007).
  67. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against γH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genet. 8 (1), e1002460 (2012).
  68. Goldstein, M., Derheimer, F. A., Tait-Mulder, J., Kastan, M. B. Nucleolin mediates nucleosome disruption critical for DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (42), 16874-16879 (2013).
  69. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO J. 29 (8), 1446-1457 (2010).

Tags

Laser MicroirradiationDNA DamageDNA RepairDNA Repair FactorsCellular ResponseReal-time AnalysisSingle-cell AnalysisFluorescently-tagged Proteins53BP1NTH1Liposome-mediated Transfection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kong, X., Cruz, G. M., Silva, B. A., Wakida, N. M., Khatibzadeh, N., Berns, M. W., Yokomori, K. Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage. J. Vis. Exp. (131), e56213, doi:10.3791/56213 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image