التحديد الكمي الوحيدات البشرية إنزيمية في المختبر واللمفاويات مورين الاتجار في فيفو
Summary
بروتوكولات للتقييم الكمي اللمفاويات إنزيمية والهجرة أدوات هامة لبحوث علم المناعة. ويرد هنا، بروتوكولا في المختبر أن التصاريح في الوقت الحقيقي، متعدد التقييم للهجرة الخلية، وكذلك تكميلية في فيفو تقنية تمكينية تتبع الخلايا الأصلية للطحال.
Abstract
إنزيمية هو الهجرة على طول تدرج كيميائية محددة1. هي المستقطبات chemotactic السيتوكينات التي تشجع الاتجار بالهاتف الخلوي مع الخصائص التشريحية والزمانية2. به وظيفة هامة من الخلايا الليمفاوية والخلايا المناعية الأخرى التي يمكن أن تكون الكمية المقررة في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب التي تسمح بتقييم به، سواء في المختبر و في فيفو، لأنواع الخلايا المختلفة بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأصلية. في المختبر، يسمح الشكل القائم على لوحة المقارنة بين شروط متعددة في وقت واحد في الوقت الحقيقي، ويمكن أن تنجز في غضون حاء – 1-4 في المختبر فحص ظروف ويمكن التلاعب بها لإدخال الخصوم، ويضع فضلا عن تميز به من تشيموكينيسيس، وحركة عشوائية. في فيفو الاتجار التقييمات، يمكن تسميته بالأصباغ الفلورية متعددة الخلايا المناعية والمستخدمة لنقل التبني. العلامات التفضيلية للخلايا يسمح للخلايا المختلطة السكان الأخذ في الحيوان نفسه، وبالتالي تقليل التباين وتقليل عدد الحيوانات اللازمة لتجربة تعمل بشكل ملائم. الهجرة في الأنسجة اللمفاوية تحدث في أقل من 1 ساعة، ويمكن أخذ عينات متعددة الأنسجة المقصورات. التدفق الخلوي عقب الحصاد الأنسجة يسمح بإجراء تحليل سريع والكمية لأنماط هجرة العديد من أنواع الخلايا.
Introduction
حصانة قوية يتطلب التنسيق المعقد الزماني والمكاني لعدد هائل أنواع الخلايا من أجل الاستجابة بشكل مناسب للإصابة والعدوى، وتوليد سيلفتوليرانسي. فقد اكتشفت عدة عشرات من مستقبلات تشيموكيني وعلى يغاندس المقابلة وتتسم الآليات الجزيئية تقدم بالخلايا المحددة التي يمكن أن تكون موجهة إلى أنسجة محددة في وقت محدد. وهكذا، دراسة إنزيمية والهجرة عنصرا لا غنى عنه لأبحاث علم المناعة. في الواقع، استخدمت مقايسة الموصوفة في المختبر مؤخرا كأداة لفحص لتحديد مساعد chemotactic أن يسرع به خلايا تي تجاه المستقطبات 19 و 21 ج-ج3. وغرض الأساليب الموصوفة هنا السماح بتقييمات كمية للخلايا المناعية إنزيمية في المختبر و في فيفو.
مقايسة الدائرة Boyden (الهجرة الخلية والغزو) أسلوب غير مكلفة واستنساخه والسريع لتقييم خلية الهجرة4،5. في التحليل القياسي، مجلس الشيوخ هو المصنف مع الخلايا، ويتم فصل بواسطة إدراج مسامية من النواب، التي تهاجر الخلايا. وفي الوقت المطلوب، يمكن إصلاح الخلايا التي تم ترحيلها إلى الجانب السفلي الإدراج والملون كوانتيتاتيون بالفحص المجهري الخفيفة. ومع ذلك، هذه القياسات تحد من جمع البيانات إلى نقطة نهاية واحدة، مما يحول دون جمع البيانات الحيوية ويمكن أن تتطلب التحسين واسعة النطاق لتحديد نقطة الوقت الأمثل للتحليل. هنا، يتم وصف تعديلات عدة تسمح في الوقت الحقيقي، والكمية ومتعدد القياسات من إنزيمية في المختبر.
للدراسات في فيفو ، يتم استخدام نقطة نهاية فنية، إلا وهي تراكم الخلايا في حجرة أنسجة معينة محددة. يتم إدخال الخلايا المسماة من قبل الجهات المانحة إلى الحيوانات المستفيدة من خلال نقل التبني. يمكن بعد ذلك تحديد هذه الخلايا المانحة التدفق الخلوي بعد الحصاد أنسجة المتلقي. وقدم أيضا هو استراتيجية التوسيم المشترك الذي يسمح لتحديد الاتجار بأنواع الخلايا المختلفة داخل حيوانا مستلم واحد. هذا الأسلوب يلغي الاختلاف بين الحيوانات من حقن الخلايا، وحسابات للتقلب بين الحيوان الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
التحديد الكمي للهجرة الخلية المناعية يمكن إنجازه باستخدام بسيطة وسريعة فحوصات في المختبر و في فيفو. نظهر إنزيمية في المختبر من وحيدات البشرية استجابة للعملية التشاورية المتعددة الأطراف-1 التدرج والتعزيز بالمصل. في فيفو، كان متفاوتاً المسمى المانحة مورين سبلينوسيتيس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها “البرنامج شوارتز لام برنارد” “الطبيب العلماء” في جامعة روكفلر، صندوق التنمية العلاجية روبرتسون في “جامعة روكفلر”، ومركز ساكلير للطب الحيوي وأبحاث التغذية في جامعة روكفلر.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
