Cuantificación de la Quimiotaxis de monocitos humanos In Vitro y linfocitos murinos, tráfico en Vivo
Summary
Protocolos para la evaluación cuantitativa de la migración y Quimiotaxis de linfocitos son herramientas importantes para la investigación de la inmunología. Aquí, se describe un protocolo en vitro que permite en tiempo real, multiplexado evaluación de migración celular, así como un complementario en vivo técnica que permite seguimiento de células nativas del bazo.
Abstract
Quimiotaxis es la migración a lo largo de un gradiente químico específico1. Quimiocinas son citocinas quimiotácticas que promueven el tráfico celular con especificidad anatómica y temporal2. Chemotaxis es una función crítica de los linfocitos y otras células inmunes que pueden ser cuantitativamente evaluaron in vitro. Este manuscrito describe métodos que permiten la evaluación de la quimiotaxis, en vitro y en vivo, para tipos de diversas células incluyendo líneas celulares y células nativas. El en vitro, formato basado en la placa permite la comparación de varias condiciones simultáneamente en tiempo real y puede terminar dentro de 1-4 h. In vitro ensayo condiciones pueden manipularse para introducir agonistas y antagonistas, como así como diferenciarse quimiotaxis chemokinesis, que es el movimiento al azar. En vivo tráfico evaluaciones, las células inmunes pueden ser marcadas con colorantes fluorescentes múltiples y utilizan para la transferencia adoptiva. El etiquetado diferencial de células permite que las poblaciones de mezclado de la célula se introduce en el mismo animal, lo que disminuye la varianza y reducir el número de animales requeridos para un experimento estadístico adecuado. Migración en el tejido linfoide ocurre en tan poco como 1 h, y múltiples compartimentos de tejido pueden ser muestreados. Citometría de flujo después de la cosecha de tejido permite un análisis rápido y cuantitativo de los patrones migratorios de múltiples tipos de células.
Introduction
Inmunidad sólida requiere la compleja coordinación temporal y espacial de una gran variedad de tipos de la célula para responder adecuadamente a la lesión, la infección y generar autotolerancia. Se han descubierto varios receptores del chemokine docena y sus correspondientes ligandos y mecanismos moleculares que caracterizado por que las células específicas pueden dirigirse en un tejido específico en un momento específico. Así, estudiar la quimiotaxis y migración es un componente indispensable de la investigación de la inmunología. De hecho, el ensayo descrito en vitro recientemente fue utilizado como una herramienta de detección para identificar quimiotáctico cofactor que acelera el quimiotactismo de las células T hacia C-C quimiocinas 19 y 213. El propósito de los métodos descritos aquí son permitir evaluaciones cuantitativas de la Quimiotaxis de células inmunitarias en vitro y en vivo.
El análisis de la cámara de Boyden (migración celular e invasión) es un método rápido, barato y reproducible para evaluar la migración de la célula4,5. En el ensayo estándar, la cámara superior es sembrada con células y está separada por una inserción porosa de una cámara inferior, en el cual las células migran. En el tiempo deseado, las células que han emigrado a la parte inferior de la inserción pueden ser fijo y manchadas para cuantificación por microscopia ligera. Sin embargo, estas mediciones restringen la recopilación de datos para un único punto de la final, que excluye la recolección de datos dinámica y pueden requerir extensa optimización para determinar el momento óptimo para el análisis. Aquí, se describen varias adaptaciones que permiten mediciones en tiempo real, cuantitativas y multiplexadas de quimiotaxis en vitro.
Estudios en vivo , se utiliza un punto funcional, es decir, la acumulación específica de células en un compartimento determinado tejido. Células de un donante previamente etiquetados se introducen animales receptores a través de transferencia adoptiva. Estas células del donante pueden identificarse posteriormente mediante citometría de flujo después de la cosecha de tejido receptor. También es una estrategia Co etiquetada que permite la determinación del tráfico de diferentes tipos de células dentro de un solo animal receptor. Este método elimina la variación entre animal de la inyección de células y representa la variabilidad entre animales fisiológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuantificación de la migración de células inmunes puede lograrse usando simple y rápido de ensayos tanto in vitro como in vivo. Demostramos en vitro la Quimiotaxis de monocitos humanos en respuesta a un gradiente de MCP-1 y aumento por el suero. In vivo, esplenocitos murinos donantes fueron etiquetados diferencialmente y tras transferencia adoptiva, fueron recuperados de los animales receptores.
Usando un lector de placa tiene la ventaja de varios puntos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el programa de Bernard L. Schwartz para los científicos de médico en la Universidad de Rockefeller, el fondo de desarrollo terapéutico de Robertson de la Universidad de Rockefeller y el centro de Sackler para Biomedicina e investigación de la nutrición en la Universidad de Rockefeller.
Materials
| RPMI-1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630-080 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Cell culture flask | Corning | 353136 | |
| Calcein AM | Thermo Fisher Scientific | C1430 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| Cell culture dish | Corning | 1007 | |
| 24 well plate | Corning | 353504 | |
| Fluoroblok Fibronectin Insert | Corning | CB354597 | |
| 15 mL conical tube | Corning | 352097 | |
| Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technology | 9998S | |
| Human Recombinant MCP-1 | Peprotech | 300-04 | |
| Adult bovine Serum | Sigma | B9433 | |
| HBSS with calcium and magnesium; no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| SpectraMax M2e plate reader | Molecular Devices | ||
| Olympus IX71 inverted fluorescence microscope | Olympus | ||
| Isothesia | Henry Schein animal health | 11695-6776-2 | Isofluorane anesthesia |
| Cell strainer 40um nylon | Falcon Corning | 352340 | |
| ACK lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| CellTracker Orange CMTMR Dye | Thermo Fisher Scientific | C2927 | Excitation: 541nm, Emission: 565nm |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo Fisher Scientific | C2925 | Excitation: 485nm, Emission: 520nm |
| 5ml syringe | BD Syringe | 309646 | |
| 1ml TB syringe | BD Syringe | 309625 | |
| THP-1 cell line | ATCC | TIB-202 | |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100228 | Excitation: 405nm, Emission: 421nm |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD19 Antibody | Biolegend | 115540 | Excitation: 405nm, Emission: 603nm |
| 96-well round bottom plate | Corning | 353077 | |
| LSRII | BD Biosciences | Flow cytometer |
References
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76 (2), 301-314 (1994).
- Ponda, M. P., Breslow, J. L. Serum stimulation of CCR7 chemotaxis due to coagulation factor XIIa-dependent production of high-molecular-weight kininogen domain 5. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (45), E7059-E7068 (2016).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Leonard, E. J., Yoshimura, T. Human monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). Immunol Today. 11 (3), 97-101 (1990).
- Crouch, M. F. An automated fluorescence based assay of neurite formation. J Neurosci Methods. 104 (1), 87-91 (2000).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Poot, M., Kavanagh, T. J., Kang, H. C., Haugland, R. P., Rabinovitch, P. S. Flow cytometric analysis of cell cycle-dependent changes in cell thiol level by combining a new laser dye with Hoechst 33342. Cytometry. 12 (2), 184-187 (1991).
- West, C. A., He, C., Su, M., Swanson, S. J., Mentzer, S. J. Aldehyde fixation of thiol-reactive fluorescent cytoplasmic probes for tracking cell migration. J Histochem Cytochem. 49 (4), 511-518 (2001).
- Kim, C. H. The greater chemotactic network for lymphocyte trafficking: chemokines and beyond. Curr Opin Hematol. 12 (4), 298-304 (2005).
