Vi rapporterer protokoller til syntese og rensning af peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer. De biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs er beskrevet.
RNA’er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål. Der er således stort potentiale i at udvikle kemiske sonder og terapeutiske ligander til anerkendelse af RNA-sekvens og struktur. Kemisk modificerede peptid nukleinsyre (PNA) oligomerer har udarbejdet for nylig, kan genkende RNA dobbelthuse i en sekvens-specifikke måde. PNAs er kemisk stabile med en neutral peptid-lignende rygrad. PNAs kan syntetiseres relativt nemt ved metoden med manuel Boc-kemi faststadie syntese. PNAs er renset med omvendt-fase HPLC, efterfulgt af molekylvægt karakterisering af matrix assisted laser desorption/Ionisation-tidspunktet for flyvning (MALDI-TOF). Non-denatureringen polyacrylamid gel elektroforese (side) teknik letter billeddannelse af triplex dannelsen, fordi omhyggeligt designet gratis RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration priser. Non-denatureringen side med ethidium bromid post farvning er ofte en nemme og informativ teknik til kendetegner bindende tilhørsforhold og særegenheder af PNA oligomerer. Typisk, flere RNA Hårnåle eller dobbelthuse med enkelt basepar mutationer kan bruges til at karakterisere PNA bindende egenskaber, såsom bindende tilhørsforhold og særpræg. 2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med den 2-aminopurine rest indarbejdet i nærheden af PNA bindingssted. 2-Aminopurine fluorescens titrering kan også bruges til at bekræfte den bindende selektivitet af modificerede PNAs mod målrettede dobbelt-strenget RNA’er (dsRNAs) over enkeltstrenget RNA’er (ssRNAs). UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet PNA-RNA dobbelthuse og PNA· RNA2 triplexes. Her, vi beskrive syntesen og rensning af PNA oligomerer indarbejde ændrede restkoncentrationer, og beskrive biokemiske og biofysiske metoder til karakterisering af anerkendelse af RNA dobbelthuse af de modificerede PNAs.
RNA’er fremvækst som vigtige biomarkører og terapeutiske mål, på grund af de seneste fremskridt i opdagelser af RNA’er roller i forordningen og katalyse af forskellige biologiske processer1,2,3. Traditionelt, har antisense-strenge været brugt til at binde til ssRNAs gennem Watson-Crick duplex dannelse3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. for nylig, triplex-dannende peptid nukleinsyrer (TFPNAs) er blevet designet til at binde til dsRNAs via Hoogsteen brint limning (figur 1)3,28,29. dsRNA regioner er til stede i fleste af de traditionelle antisensstoffer-målrettet RNA’er, herunder pre-mRNAs og mRNAs, før eller pri-miRNAs3, og mange andre ikke-kodende RNA’er1,26,27. Målretning dsRNAs gennem triple helix dannelse ved hjælp af TFPNAs kan være en fordel på grund af dens struktur specificitet og er med stort potentiale for brug i genoprette de normale funktioner af RNA’er, som er dysregulated i sygdomme, f.eks.
Den nyligt offentliggjorte arbejde af Rozners et al., og os3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, rapporterede bestræbelser på at forbedre selektiv bindingen af modificerede TFPNAs mod dsRNAs med øget affinitet. Vi har udviklet syntese metoder for rationelt designet PNA monomerer (figur 2), herunder thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 og guanidin modificerede 5-methyl cytosin (Q) monomer31. Gennem forskellige biokemiske og biofysiske karakterisering metoder, har vi bevist, at relativt korte PNAs (6-10 restkoncentrationer) indarbejde L og Q restkoncentrationer vis forbedret anerkendelse af Watson-Crick G-C og C-G basepar, henholdsvis i dsRNAs. Derudover Vis sammenlignet med umodificerede PNAs, PNAs med L og Q restkoncentrationer mere selektive bindende mod dsRNA over ssRNA og dsDNA. Guanidin funktionalitet42 i Q base giver PNAs at indtaste HeLa celler31.
I vores laboratorium, vi syntetisere PNAs af den manuelle Boc-kemi (Boc eller t– Boc står for tert-butyloxycarbony (Se figur 2) faststadie syntese metode4. Syntesen af PNA monomer med Boc som Amin beskytte gruppe er praktisk som gruppen Boc er sterically mindre pladskrævende i forhold til fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin beskytte gruppe, som kan være gavnlige i PNA monomer kobling den solid støtte. Gruppen Boc er syre-labil og kan nemt fjernes med solid støtte ved 20-50% trifluoreddikesyre (TFA) i dichlormethan (DCM) under PNA syntese. En automatiseret peptid synthesizer kan være ansat til at syntetisere PNA oligomerer; dog er 3-5-fold overskydende af PNA monomer behov for en automatiseret peptid synthesizer. Manuel syntese kræver betydeligt mindre PNA monomer (2-3-fold overskydende), med hver kobling let overvåges af Kaiser test43. Desuden, mange automatiserede synthesizere er ikke kompatible med Boc strategi syntesen fra anvendelse af ætsende TFA under Boc fjernelse trin.
PNA oligomerer kan renses ved omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) efterfulgt af molekylvægt karakterisering af MALDI-TOF (figur 3 og 4)30, 31. vi ansætter ikke-denatureringen side at overvåge triplex dannelse, skyldes, at frie RNA duplex konstruktioner og PNA bundet triplexes ofte viser forskellige migration satser (figur 5)30,31 . Ingen mærkning er nødvendig, hvis effektive efter farvning kan opnås for begge RNA duplex og PNA· RNA2 triplex bands. En forholdsvis lille mængde af prøven er nødvendig for ikke-denatureringen side eksperimenter. Dog kan lastning (inkubation) buffere og de kører buffere (pH 8.3) ikke være det samme, hvilket resulterer i målinger er begrænset til de kinetisk stabil triplexes, fordi en relativt høj pH-værdi på 8,3 kan betydeligt destabilisere en triplex.
2-Aminopurine er en isomer af adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine fluorescens intensitet (med en emission peak på omkring 370 nm) er følsomme over for lokale strukturelle ændringer, og er velegnet til overvågning af triplex dannelse med 2-aminopurine resten indarbejdet i nærheden af PNA bindende () websted Figur 6) 31. i modsætning til mange andre farvestoffer, der viser fluorescens emission i det synlige spektrum, 2-aminopurine-mærket RNA kan blive udsat for rumbelysning uden foto blegning. I modsætning til side eksperiment, hvor en kørende buffer til pH 8.3 er ofte nødvendig, 2-aminopurine baseret fluorescens titrering tillader måling af bindende i én løsning ved en bestemt pH, og således kan tillade måling og registrering af relativt svag og kinetisk ustabil binding ved ligevægt.
UV-absorbans-fundet termisk smeltende eksperimenter tillader måling af termisk stabilitet dobbelthuse (figur 7)31 og triplexes30,32,44,45. Afhængigt af længden og sekvens sammensætning, smeltning af triplexes kan eller kan ikke vise en tydelig overgang. Termodynamiske parametre kan fås, hvis opvarmning og afkøling kurver overlapper hinanden. Nøjagtig termodynamiske parametre kan fås af isotermisk titrering kalorimetri (ITC)32; dog er forholdsvis store mængder af prøver generelt kræves for ITC.
RNA duplex-bindende PNA oligomerer (f.eks, 10-mers) er mellemstore molekyler og dermed kan vise elektroforese mobilitet Skift ved binding til RNA’er med en sammenlignelig eller lidt større størrelse (fx, 50-mer eller mindre). Hvis en RNA er betydeligt større end PNA, kan titrering af PNA i RNA ikke arbejde på grund af en begrænset gel mobilitet Skift. Således, den store RNA kan afkortes for ikke-denatureringen side assays. Titrering af en stor RNA i en fluorophore-mærket PNA giver mulighed for overvågning af triplex dannelsen af en ikke-denatureringen agarosegel med eksemplet indlæses i midten af gel40.
For en titrering eksperiment af ikke-denatureringen side med en konstant total koncentration af RNA bruger vi typisk en umærket RNA-koncentration på 1 µM til effektiv post farvning af gratis RNA og triplex bands af ethidiumbromid. En RNA koncentration så lavt som 0,2 µM kan også være tilstrækkelige afhængigt af RNA konstruere31. Koncentrationen af den umærkede RNA (0,2 µM) bestemmer, at Kd værdier, der kan måles præcist bør være omkring 0,2 µM eller større. Andre farvning farvestoffer kan bruges til at effektivisere farvning. Alternativt, vores ikke-offentliggjorte data tyder på, at Cy3 dye-mærket RNA’er kan anvendes til ikke-denatureringen side forsøg til at måle tight bindende begivenheder.
At 2-aminopurine er kun moderat fluorescerende, er 2-aminopurine fluorescens titrering også begrænset til måling af bindende med Kd værdier tæt på eller over 0,2 µM31. RNA eller PNA kan være mærket med en forholdsvis lys farve til kvantificering af en forholdsvis stram bindende løsning gennem fluorescens titrering, hvis bindende resulterer i ændringer i fluorescens signaler53,54,, 55.
Strategien med at målrette RNA strukturer af dsRNA-bindende PNAs er blevet testet for et begrænset antal RNA’er. Det er sandsynligt, at bindende egenskaber kan variere for dsRNAs med forskellige sekvenser og basepar kompositioner. Man kan altid vælge purin-rige strand af en duplex for udformningen af TFPNAs. Det er vigtigt at forstå, hvordan træk Q· C-G tredobler kan påvirke stabiliteten i en triplex. Mere omfattende sekvens-afhængige undersøgelser er klart behov for at forstå sekvens-afhængige bindende egenskaber af TFPNAs.
Bindende affinitet af TFPNAs kan forbedres yderligere ved at øge længden og/eller yderligere ændring af baser og rygbenet56,57 af TFPNAs. Men en kontinuerlig duplex region må ikke ofte bestå af mere end 10 på hinanden følgende basepar uden forstyrrelsen af ikke-Watson-Crick strukturer. Man kan konjugerede TFPNAs med små molekyler til anerkendelse af ikke-Watson-Crick strukturer støder op til dsRNA regioner. I princippet forventes en TFPNA-lille molekyle konjugat at have forbedret bindende affinitet og specificitet i forhold til en TFPNA eller lille molekyle alene. Imidlertid de kemiske og fysiske egenskaber af linker til konjugation58,59,60,61,62,63,64 skal optimeres.
Det faktum, at TFPNAs kan selektivt binde til dsRNAs over ssRNAs og dsDNAs antyder, at det er muligt at udvikle TFPNAs som meget nyttige kemiske sonder og potentielle terapeutiske ligander gennem regulering af RNA strukturdynamik og interaktioner med proteiner og metabolitter. Cellulære optagelse af TFPNAs kan lettes gennem konjugering med celle-gennemtrængende fraspaltning som små molekyler, peptider, og nanopartikler eller kompleks med Supramolekylær strukturer såsom Liposomer5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Yderligere kan functionalization af TFPNAs med bioimaging tags som fluorophores og radioisotoper lette afsløringen, billedbehandling, og målretning af funktionelle RNA strukturer i levende organismer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Singapore Ministeriet for uddannelse (MOE) Tier 1 (RGT3/13 og RG42/15-G.C.) og MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 og MOE2015-T2-1-028 til G.C.).
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets | Alfa Aesar | 87956 | |
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) | Sigma-Aldrich | 532444 | |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Alfa Aesar | A11801 | |
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) | Alfa Aesar | B25251 | |
Acetic anhyride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
Kaiser Test Kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | |
Unmodified PNA monomers | ASM Research Chemicals GmbH | 5004007, 5004008, 5004009, 5004010 | |
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH | Sigma-Aldrich | B8389 / 47624 | |
Thioanisole | Alfa Aesar | A14846 | |
1,2-Ethanedithiol | Alfa Aesar | L12865 | |
Trifluoromethanesulfonic acid | Alfa Aesar | A10173 | |
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 | Merck Millipore | 150838 | |
RNA Oligos | Sigma-Aldrich | Customized | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 39468 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Alfa Aesar | J15694 | |
HEPES | Lonza | 17-737E | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A8887 | |
N.N'-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-rad | 161-0700 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-rad | 161-0800 | |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 | 1st Base | BUF-3010-10X1L | |
Glycerol | Promega | H5433 | |
Ethidium bromide (10 mg/mL) | Bio-rad | 161-0433 | |
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) | Hellma Analytics | 105.250-QS |