AFM e Microrheology na célula de embrião de Zebrafish gema
Summary
A falta de ferramentas para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo impede Validando seus papéis durante o desenvolvimento. Utilizamos microscopia de força atômica (AFM) e acompanhamento de nanopartículas para quantificar as características mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Esses métodos são confiáveis e amplamente aplicável, evitando intervenções intrusivas.
Abstract
Elucidar os fatores que direcionam a organização espaço-temporal de evolução tecidos é uma das principais finalidades no estudo do desenvolvimento. Várias proposições afirmam ter sido importantes contribuições para o entendimento das propriedades mecânicas de células e tecidos em sua organização spatiotemporal em diferentes processos de desenvolvimento e morfogenéticas. No entanto, devido à falta de ferramentas confiáveis e acessíveis para medir propriedades materiais e parâmetros tensional na vivo, validar estas hipóteses tem sido difícil. Aqui nós apresentamos métodos empregando microscopia de força atômica (AFM) e partículas de rastreamento com o objectivo de quantificar as propriedades mecânicas da célula de gema intacta zebrafish embrião durante epiboly. Epiboly é um processo de desenvolvimento precoce conservado cujo estudo é facilitado pela transparência do embrião. Esses métodos são simples de implementar, confiáveis e amplamente aplicável, desde que eles superam intrusivas intervenções que poderiam afetar a mecânica do tecido. Uma estratégia simples foi aplicada para a montagem de amostras, gravação de AFM e injeções de nanopartículas e rastreamento. Esta abordagem faz com que esses métodos facilmente adaptável para outros tempos do desenvolvimento ou organismos.
Introduction
Os princípios físicos subjacentes o controle biomecânico de processos morfogenéticas são largamente indefinidos. Enquanto estudos biomecânicos a nível molecular e celular estão se reunindo considerável impulso, a exploração dos parâmetros biomecânicos no nível do tecido/organismo está em sua infância. Hidrodinâmico regressão1 ou vídeo microscopia de força2 permite aos investigadores distinguir forças ativas e passivas, enquanto o de microcirurgia laser3, ou a menos intrusiva microscopia de força atômica (AFM) de células dissociadas4 ou na vivo 5 ou nanopartículas microrheology6 permitem a antecipação de um tecido propriedades mecânicas e respostas.
AFM é uma técnica topográfica tridimensional com resolução de rugosidade da superfície e conformidade da deflexão de dicas do cantilever em caso de contacto com uma superfície sondado7de alta resolução atômica. Diferentes metodologias empregando AFM foram desenvolvidas para investigar as propriedades da superfície, incluindo medição de atrito, forças de adesão e nas propriedades viscoelásticas de diversos materiais. Recentemente, a AFM tem emergido como uma ferramenta poderosa para recuperar informações sobre as propriedades mecânicas de amostras biológicas. Em particular, AFM não invasiva pode extrair o módulo de cisalhamento complexo de células únicas aplicando recuos oscilatórios com uma ponta de micro ligada a um cantilever de constante flexão conhecido8. Isto permite-nos inferir a resultante de forças. No entanto, AFM não é exclusiva e diferentes metodologias permitem extrair dados reológicos e propriedades mecânicas de células individuais (por exemplo, micropipeta aspiração9, magnético de torção cytometry (MTC)10, ou uniaxial elástica testando a11).
No entanto, a aplicação dessas novas metodologias para processos complexos morfogenéticas não é simples. Os principais desafios enfrentados na determinação das propriedades mecânicas dos tecidos embrionários são os pequenos (µm a mm), macio (no 102 – 10 intervalo de4 Pa) e natureza de visco-elástico (dando origem a fenómenos de tempo-dependente) do material12. Portanto, é importante adaptar os métodos utilizados para a determinação das propriedades mecânicas (rigidez, viscosidade, aderência) para o caso específico de embriões e organismos em desenvolvimento. Duas questões importantes devem ser tomadas em consideração quando analisando reológicas abordagens para estudar o desenvolvimento: para evitar interferência intrusiva e para fornecer fácil acessibilidade. Neste cenário, aspiração micropipeta, MTC e teste de tração apresentam limitações. No primeiro caso, a alta deformação que sofre de uma célula pode alterar suas propriedades fisiológicas e mecânicas9. No segundo caso, a necessidade de aderir firmemente o tecido experimental a um substrato para garantir que as tensões aplicadas deformam o citoesqueleto localmente também poderia apresentar efeitos no estado de ativação das células e, consequentemente, em suas características mecânicas10 . Abordagens de tração uniaxiais, últimas são limitadas pela geometria do desenvolvimento de organismos e acessibilidade11.
AFM parece ser mais adequado para o estudo de processos de desenvolvimento, pois permite o estudo de amostras biológicas diretamente em seu ambiente natural sem qualquer preparação da amostra pesada. Além disso, como a dissociação dos tecidos embrionários é geralmente difícil, o tamanho reduzido das sondas AFM fornece um alto grau de versatilidade com nenhuma limitação na escolha do tipo de meio (aquoso ou aquosos), temperatura da amostra ou produto químico composição da amostra. AFM é versátil o suficiente para ser aplicado a grandes domínios e escalas de tempo e tem sido empregada para recuperar propriedades materiais de tecidos em diferentes estádios de desenvolvimento ou em condições fisiológicas. Todo nativos tecidos tais como artérias13 ou ossos14 foram estudadas do ponto de vista topográfico e em alguns casos, como a esclera, propriedades mecânicas também foram recuperados15. Topografia também tem sido explorada em embriões ao vivo, permitindo a visualização de, por exemplo, o rearranjo de célula durante a morfogênese em Xenopus16. Protocolos de preparação abrangente, última amostra foram desenvolvidos para determinar parâmetros mecânicos durante os processos de desenvolvimento diferentes. Nanoindentação mapas foram gerados em secções de tecido unfixed nativo para o filhote embrionário do aparelho digestivo,11; propriedades adesivas e mecânicas obtida para células individuais ectoderme, mesoderme e endoderme progenitoras isoladas de gastrulating zebrafish4embriões; realizadas medidas de rigidez para o epiblasto e raia primitiva em explantes de embriões aviários17; e um padrão distinto de gradientes de rigidez definidos diretamente no cérebro embrionário do Xenopus5.
Um salto qualitativo significativo para a aplicação de AFM para explorar o desenvolvimento embrionário pode vir de aproximação simples processos morfogenéticas acessíveis. Zebrafish epiboly é um evento essencial e conservado, em que diferentes tecidos coordenam em um espaço restrito esférico para direcionar a expansão da Drosophila em poucas horas. No início da epiboly zebrafish (fase esférica), uma camada superficial de células, a camada envolvente (EVL), abrange um boné semi-esférico de blastómeros centrada no polo animal do embrião sentado em uma cela sincicial gema maciça. Epiboly consiste a expansão cortical ala vegetal do EVL, as células profundas (DCs) da Drosophila e a camada externa da célula em torno da gema gema sincicial (E-YSL). Epiboly termina com o encerramento do EVL e as DCs no polo vegetal18,19,20. Como e onde as forças são geradas durante a epiboly e como eles são acoplados globalmente ainda não está claro1,21.
Aqui descrevemos detalhadamente como aplicar AFM para inferir Propriedades tecido mecânico passivo durante progressão epiboly a gema de zebrafish celular na vivo. Para isso, usamos pequenas microesferas anexadas a AFM cantilevers como sondas. Isto permite a recuperação de informações locais precisas dentro da superfície de células não-uniforme de gema e estudar gradientes tensionais e sua dinâmica ao longo do tempo. AFM alternativo aproxima-se como aqueles que usam Cunha cantilevers22, will não processar dados local que é suficientemente precisos. A técnica de cunha, que requer habilidades de manipulação muito cuidado para colar um pedaço maior do que o tamanho da amostra no final do cantilever, não é adequada para sondar o embrião (~ 2 dobras maiores que o comprimento do cantilever) mecânica.
Modelagem e caracterizar as propriedades viscoelásticas de células de forma qualitativa e quantitativa permitem uma melhor compreensão da sua biomecânica. Do ponto de vista biomecânico, é essencial para compreender a epiboly e não apenas a demanda conhecimento em medições de tensão cortical e dinâmica, que pode ser extraída por AFM; assim, não há necessidade de informações sobre as propriedades biofísicas do tecido. Para extrair essas informações, uma variedade de técnicas de reologia celular foram desenvolvidos ao longo dos anos para caracterizar os diferentes tipos de células sob diferentes condições fisiológicas23. Eles incluem AFM, MTC e pinças ópticas (OT). Esses métodos, no entanto, têm provados inadequados para mesoscópica análises na escala de embriões ou órgãos. Como alternativa, adaptámos com êxito acompanhamento de nanopartículas microrheology6 para medições reológicas na vivo . Esta técnica analisa os deslocamentos browniano das partículas isoladas e infere Propriedades micromecânicas local.
Junto microrheology AFM e nanopartículas permite a definição de dinâmica tensional cortical e propriedades mecânicas internas da gema durante epiboly. Esta informação apoia plenamente um modelo no qual anisotrópica stress desenvolve-se em consequência as diferenças na resposta de deformação do EVL e a camada citoplasmática de gema (YCL) para a contração isotrópica actomyosin do córtex E YSL é essencial para o movimento líquido direcional da EVL e epiboly progressão1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui nós mostramos que as propriedades do material e alguns parâmetros biomecânicos da célula de gema zebrafish durante epiboly podem ser facilmente estimados pela AFM e nanopartículas microrheology.
Enquanto a AFM tem sido empregada para recuperar características reológicas de células e tecidos em condições fisiológicas,4,5,25,28, aqui nós desenvolvemos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Amayra Hernández-Vega e Philippe-Alexandre Pouille para participar na criação de base para estes protocolos. Agradecemos também a plataforma de imagem Molecular do IBMB-PCB, Xavier Esteban e membros do laboratório de apoio contínuo. O programa de grupos consolidados da Generalitat de Catalunya e DGI e consolidar subsídios do Ministério da economia e competitividade da Espanha para EMB e DN apoiou este trabalho.
Materials
| Inverted optical microscope | Nikon | TE2000 | Visualization of the sample and AFM cantilever |
| Atomic force microscope (AFM) | Custom made | – | Any commercialized AFM could be employed |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM780 | Nanorheology data collection |
| Agarose D1 Low EEO | Conda | 8016.00 | Casting embryos |
| Ultrapure LMP Agarose (low melting) | Invitrogen | 16520-100 | Securing embryos |
| Zebrafish Microinjection and Transplantation Molds | World Precision Instruments | Z-MOLDS | Casting embryos. Custom made with the original dimensions can also be employed |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter |
| Si3N4 cantilever | Novascan | PT.GS | Measuring the embryo by AFM. Spherical tip: 4.5 µm diameter and k=0.01 N/m |
| Fluorescent nanoparticles | Life Technologies | FluoSpheres F8811, | For tracking nanorheology |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-2000 | Fabricating tailored microneedles |
| Borosilicate capillary glass | Warner Instruments | G100TF-4 | Fabricating tailored microneedles |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | Manipulating the micropipette |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet Express | Controlling injection time and pressure |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the embryos during injection |
| Analysis Software | MathWorks | Matlab | Analyzing AFM and particle tracking data |
| Zebrafish | AB and TL wild type | – | Strains employed for embryo collection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting embryos for nanorheology data collection |
| Stage micrometer | FST | 29025-02 |
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