근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

Eliza L. Lewis; Aaron M. Leconte

doi:10.3791/56228

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

근 적외선 형광 레이블이 DNA 아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법으로 시각을 사용 하 여 DNA 중 합 효소 활동 분석 결과

13.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/56228

⸱

2017년 10월 6일

Eliza L. Lewis¹ , Aaron M. Leconte¹

¹Department of Chemistry, W.M. Keck Science Department of Claremont Mckenna, Pitzer, and Scripps College

이 논문에서

요약

이 프로토콜의 근처-적외선 붙일 레이블된 DNA 젤 전기 이동 법 젤 이미지를 사용 하 여 변경 내용 관찰을 통해 수정 된 DNA의 DNA 중 합 효소 합성의 특성을 설명 합니다. 아크릴 아 미드 젤의 크기에 따라 다른 속도로 이동 하는 짧은 핵 산 분리의 고해상도 이미징에 사용 됩니다.

초록

어떤 효소에 대 한 강력 하 고, 양적 메서드는 네이티브와 조작 효소의 특성에 대 한 필요. DNA polymerases에 대 한 DNA 합성 생체 외에서 DNA 종합 분석 결과 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 뒤를 사용 하 여 특징 수 있습니다. 이 분석 결과의 목표 자연 DNA와 수정된 DNA (M-DNA)의 합성을 계량 하는 것입니다. 이러한 접근은 oligonucleotides 단일 뉴클레오티드 분해능, 효소 oligonucleotide 종합 동안 관찰의 개별 단계 사용을 해결 하는 데 특히 유용 합니다. 이러한 메서드는 생화학 및 생물 DNA 종합의 개별 단계, DNA 종합 그리고 DNA 바인딩 선호도의 오류율의 정상 속도 상수 측정 등 속성의 평가에 적용 되었습니다. 사용 하 여 구성 (NTP), M-DNA, 또는 돌연변이 DNA polymerases, 쌍을 효과적으로 평가 수 있는 기판-DNA 중 합 효소의 상대적 유틸리티 포함 하 되이 제한 되지 않고, 수정된 nucleoside 된 수정. 여기, 우리가 분석 결과 자체, 전례 없던 뇌관 DNA 라벨 근처-적외선 붙일 DNA 라는 등 전략에 맞게 만들 수 있어야 합니다 변경 내용을 포함 하 여 선발. 또한, 우리 쏟아져 아크릴 아 미드 젤에 대 한 중요 한 기술 단계 상세는 하 고 실행 하 고, 종종 수 있는 기술적으로 도전.

서론

DNA polymerases 정확 하 고 효율적인 DNA 합성을 수행 하 고 게놈 무결성을 유지 하기 위해 필수적입니다. 오류 없이 수백 초 당 뉴클레오티드를 합성 하는 능력 또한 분자 생물학 및 생명 공학에서 DNA polymerases 필수 도구를 만든다. 그러나, 이러한 속성은 또한 M-DNA 기판;에 대 한 응용 프로그램 제한 일반적으로 말하자면, 자연 DNA polymerases 수 없습니다 음성 합성 많은 잠재적으로 귀중 한 M-DNA 기판, 가능성이 인해 비표준 기판에 vivo에서를 사용 하 여에 대 한 높은 선택적 압력에. 많은 그룹 돌연변이 DNA polymerases M-DNA 합성¹^,²^,³^,^,⁴⁵;의 생성을 지시 진화 접근을 개발 했습니다. 이러한 노력은 DNA⁶^,^,⁷⁸의 바이오 유틸리티를 확장 했습니다....