क्रॉस-जेट-मुक्त और निशानदेही मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच Immunoassays के लिए स्नैप चिप
Summary
हम बस दो स्लाइड तड़क द्वारा क्रॉस-जेट-मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassays प्रदर्शन के लिए एक स्नैप चिप प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन । एक स्नैप उपकरण मज़बूती से microarray-से-microarray स्थानांतरण के लिए उपयोग किया जाता है । स्नैप चिप क्रॉस-संदूषण के बिना विभिन्न रिएजेंट के colocalization की आवश्यकता होती है किसी भी जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
मल्टीप्लेक्स प्रोटीन विश्लेषण बेहतर नैदानिक संवेदनशीलता और एक प्रोटीन की तुलना में सटीकता दिखाया गया है । एंटीबॉडी microarrays सूक्ष्म पैमाने पर immunoassays के हजारों के लिए अनुमति एक ही चिप पर एक साथ प्रदर्शन किया । सैंडविच परख प्रारूप दो एंटीबॉडी के साथ प्रत्येक लक्ष्य का पता लगाने के द्वारा परख विशिष्टता में सुधार, लेकिन पार से एजेंट के बीच जेट इस प्रकार अपने मल्टीप्लेक्स क्षमताओं को सीमित से ग्रस्त है । एंटीबॉडी colocalization microarray (ACM) को क्रॉस-रिजेट-फ़्री मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन डिटेक्शन के लिए विकसित किया गया है, लेकिन इसकी आवश्यकता है एक महंगी निशानदेही पर-microarray निर्माण के लिए साइट की परख के दौरान । इस काम में, हम एक तस्वीर चिप प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन है कि स्थानांतरण microarray से microarray बस दो चिप्स एक साथ तड़क द्वारा, इस प्रकार कोई निशानदेही का नमूना मशीन और बाद में आवेदन का पता लगाने के एंटीबॉडी (dAbs) के दौरान की जरूरत है पूर्व-देखे गए स्लाइडों का संग्रहण, स्लाइड तैयारी को परख निष्पादन से dissociating । दोनों एकल और दोहरे हस्तांतरण तरीकों दो microarrays और दोनों तरीकों के लिए स्लाइड निर्माण के बीच सटीक संरेखण को प्राप्त करने के लिए प्रस्तुत कर रहे है वर्णित हैं । परिणाम बताते हैं कि & #60; ४० माइक्रोन संरेखण डबल हस्तांतरण के साथ प्राप्त किया गया है, ६२५ धब्बे की एक सरणी घनत्व तक पहुँचने/ एक ५०-plexed immunoassay को मल्टीप्लेक्स्ड प्रोटीन विश्लेषण में स्नैप चिप की प्रयोज्यता प्रदर्शित करने के लिए आयोजित किया गया है । ३५ प्रोटीन का पता लगाने की सीमाएं स्नातकोत्तर की श्रेणी में हैं/
Introduction
कई प्रोटीन शामिल करने वाले विमार्क्स का एक पैनल1,2जैसे जटिल रोगों के निदान में एक एकल स्मार्कर की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता प्रदान कर सकता है । एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा) स्वर्ण मानक नैदानिक प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है कम स्नातकोत्तर में पता लगाने की एक सीमा पर प्राप्त करने/प्लाज्मा में एमएल, लेकिन परख3,4,5प्रति एक लक्ष्य के लिए सीमा । एंटीबॉडी microarrays एक एकल माइक्रोस्कोप पर समानांतर में आयोजित की लघुकृत परख के हजारों समायोजित करने के लिए विकसित किया गया है6,7,8. हालांकि, इस विधि के मल्टीप्लेक्स क्षमता dAbs का एक मिश्रण के आवेदन से उत्पन्न होने वाली, एजेंट चालित पार-जेट द्वारा सीमित है, और यह लक्ष्य की बढ़ती संख्या के साथ और अधिक समस्याग्रस्त हो जाता है9,10 , 11. पीएलए एट अल. ने कहा है कि 4N के रूप में एक मल्टीप्लेक्स सैंडविच परख तराजू के परिणामस्वरूप भेद्यता (एन-1) जहां n लक्ष्य की संख्या12है ।
एंटीबॉडी microarrays में क्रॉस-रिजेट को कम करने के लिए, एंटीबॉडी colocalization microarray (ACM) को हमारी प्रयोगशाला में मल्टीप्लेक्स सैंडविच परख12के लिए विकसित किया गया है । कैद एंटीबॉडी (कैब) एक microarray निशानदेही के साथ एक सब्सट्रेट पर देखा जाता है । ब्लॉकिंग नमूने सतह पर लागू होते हैं, और उसके बाद व्यक्तिगत dAbs cAb-antigen जटिल के साथ एक ही स्थान पर देखा जाता है के बाद । एंटीबॉडी और एंटीजन के बीच सभी क्रॉस-जेट परिदृश्यों ACM के साथ कम किया जा सकता है, और स्नातकोत्तर/एमएल पर पता लगाने की सीमा हासिल की गई है । हालांकि, परख प्रोटोकॉल की तैयारी और प्रयोग के दौरान dAbs खोलना की आवश्यकता है एक ऑन-साइट संरेखण उद्देश्य है, जो महंगा है और समय लेने के लिए उच्च परिशुद्धता के साथ microarray निशानदेही का उपयोग कर, में इस प्रौद्योगिकी के व्यापक आवेदन सीमित अंय प्रयोगशालाओं । एक handheld ACM, नाम स्नैप चिप क्रॉस-जेट मुक्त और निशानदेही मुक्त मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassays13,14,15के लिए विकसित किया गया है । कैब और dAbs पूर्व एक परख स्लाइड और microarray प्रारूप में क्रमशः एक स्थानांतरण स्लाइड पर देखा और संग्रहीत कर रहे हैं । परख के दौरान, स्लाइड प्राप्त कर रहे है और dAbs के एक microarray सामूहिक बस दो चिप्स एक साथ तड़क द्वारा परख स्लाइड पर स्थानांतरित कर रहे हैं । एक तस्वीर उपकरण विश्वसनीय रिएजेंट हस्तांतरण के लिए प्रयोग किया जाता है । Nitrocellulose एक अपेक्षाकृत बड़ी एंटीबॉडी बाध्यकारी क्षमता के साथ लेपित स्लाइडें परख स्लाइड के रूप में तरल बूंदों को अवशोषित और इस तरह reagent स्थानांतरण की सुविधा के रूप में इस्तेमाल किया गया है, तथापि, स्लाइड नियमित रूप से कांच स्लाइड और microarray से अधिक महंगे है गैर-पारदर्शी स्लाइड के साथ संगत स्कैनर संकेत प्राप्ति के लिए आवश्यक हैं ।
इस काम में, हम एक तस्वीर चिप के साथ एक मल्टीप्लेक्स सैंडविच immunoassay प्रदर्शन के प्रोटोकॉल का प्रदर्शन । microarray-टू-microarray से अधिक सुविधाजनक और विश्वसनीय रिएजेंट स्थानांतरण के लिए एक उपंयास स्नैप उपकरण विकसित किया गया है । महत्वपूर्ण बात, यहां हम स्नैप चिप के साथ नियमित रूप से गिलास स्लाइड पर एजेंट स्थानांतरण विधि की स्थापना की है । १०२४ स्पॉट सफलतापूर्वक हस्तांतरित और एक गिलास स्लाइड पर गठबंधन किया गया, काफी ज्यादातर प्रयोगशालाओं में इस तकनीक के उपयोग का विस्तार ।
Protocol
1. निर्माण और स्नैप चिप्स का भंडारण एकल अंतरण विधि ( चित्रा 1a ) स्पॉट कैब सॉल्यूशन युक्त ४०० & #181; छ/एमएल एंटीबॉडी और फॉस्फेट-बफर खारा में 20% ग्लिसरॉल (पंजाब) एक nitrocellulose पर (या एक कार्?…
Representative Results
Discussion
इस काम में, हमने एक स्नैप चिप तकनीक प्रस्तुत की है जो बुनियादी प्रायोगिक सेटअप के साथ शोधकर्ताओं के लिए क्रॉस-जेट-मुक्त मल्टीप्लेक्स immunoassays को व्यापक रूप से उपलब्ध कराती है । मौजूदा एंटीबॉडी microarrays से अलग, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम inkjet निशानदेही के उपयोग के लिए डॉ रोब Sladek धंयवाद । हम स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए कनाडा के संस्थानों से अंतिम समर्थन स्वीकार (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद (NSERC), कनाडा के कैंसर सोसायटी अनुसंधान संस्थान और कनाडा के नवाचार के लिए फाउंडेशन (CFI) । शलया एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी से धंयवाद समर्थन करते हैं ।
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
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