Fastgør Chip for Cross-Country-reactivity-fri og Spotter multipleksede Sandwich immunassays
Summary
Vi demonstrere en snap chip teknologi til at udføre Cross-Country-reactivity-fri multipleksede sandwich immunassays ved blot snapping to dias. En snap apparatet bruges til at pålideligt overføre reagenser fra microarray til microarray. Snap chip kan bruges til enhver biokemiske reaktioner, der kræver colocalization af forskellige reagenser uden kontaminering.
Abstract
Multiplex proteinanalyse har vist superior diagnostiske følsomhed og nøjagtighed i forhold til enkelt proteiner. Antistof microarrays mulighed for tusindvis af mikro-skala immunassays udføres samtidigt på en enkelt chip. Sandwich assay format forbedrer assay specificitet ved at opdage hver målet med to antistoffer, men lider af krydsreaktivitet mellem reagenser, hvilket begrænser deres multiplexing kapaciteter. Antistof colocalization microarray (ACM) er blevet udviklet til Cross-Country-reactivity-fri multipleksede protein påvisning, men kræver et dyrt spotter på stedet for microarray fabrikation under assays. I dette arbejde udviser vi en snap chip-teknologi, som overfører reagens fra microarray til microarray af blot snapping to chips sammen, således ingen spotter kræves under prøven inkubation og efterfølgende anvendelse af påvisning antistoffer (klatter) på opbevaring af pre plettede dias, skaber dias forberedelse fra assay udførelse. Både enkelt og dobbelt overførselsmetoder præsenteres for at opnå præcise tilpasning mellem de to microarrays og dias fabrikation for begge metoder er beskrevet. Resultaterne viser, at < 40 μm justering er opnået med dobbelt overførsel, at nå en array tæthed af 625 steder/cm2. En 50-plexed immunoassay har gennemført for at påvise anvendeligheden af snap chip i multipleksede proteinanalyse. Grænserne for påvisning af 35 proteiner er i den vifte af pg/mL.
Introduction
Et panel af biomarkører bestående af flere proteiner kan give højere følsomhed og specificitet end en enkelt biomarkør i diagnosticering af komplekse sygdomme såsom kræft1,2. Enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) har været guldstandarden teknologi anvendes i kliniske laboratorier at nå en grænse på opdagelse på lav pg/mL i plasma, men grænser for ét mål pr. assay3,4,5. Antistof microarrays er blevet udviklet for imødekommende tusindvis af miniaturized assays gennemført parallelt på en enkelt mikroskop dias6,7,8. Men den multiplexing kapacitet af denne metode er begrænset af reagens-drevet krydsreaktivitet, der følger af anvendelsen af en blanding af ising, og bliver det mere problematisk med et stigende antal mål9,10 , 11. Pla mfl. har erklæret, at den resulterende sårbarhed af en multiplex sandwich assay skalaer som 4N(N-1), hvor N er antallet af mål12.
For at afbøde krydsreaktivitet i antistof microarrays, antistof colocalization microarray er (ACM) blevet udviklet i vores laboratorium for multiplex sandwich assay12. Capture antistoffer (førerhuse) er spottet på et underlag med et microarray spotter. Efter blokering prøver på overfladen, og derefter individuelle klatter er plettet på de samme steder med cAb-antigen kompleks. Alle krydsreaktivitet scenarier mellem antistoffer og antigener kan afbødes med ACM, og påvisningsgrænser ved pg/mL er blevet nået. Men assay protokollen kræver forberedelse og spotting klatterne under eksperimenter ved hjælp af en on-site microarray spotter med høj præcision for justering formål, som er dyrt og tidskrævende, begrænse den brede anvendelse af denne teknologi i andre laboratorier. En håndholdt ACM, opkaldt snap chip er blevet udviklet Cross-Country-reactivity-fri og spotter-fri multiplex sandwich immunassays13,14,15. cAbs og klatter er pre spottet på en analyse og en overførsel dias henholdsvis i microarray format og gemt. Under analysen, dias er hentet og et microarray af klatter overføres kollektivt diaset assay som blot snapping de to chips sammen. En snap apparatet bruges til pålidelige reagens overførsel. Nitrocellulose belagt dias med en relativt stor antistof bindende kapacitet har været brugt som assay dias til at absorbere flydende dråber og dermed fremme reagens overførsel, imidlertid diasene er dyrere end almindelige glas lysbilleder og microarray scannere kompatibel med uigennemsigtige dias er nødvendige for signal erhvervelse.
I dette arbejde viser vi udfører en multiplex sandwich immunassay med en snap chip-protokollen. En roman snap apparater er blevet udviklet for mere praktisk og pålidelig reagens overførsel fra microarray til microarray. Vigtigere, har her vi etableret reagens overførselsmetode på regelmæssig glas dias med snap chip. 1024 steder blev overført og tilpasset til et glas dias, væsentlig udvidelse af brugen af denne teknologi i de fleste laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde har vi præsenteret en snap chip-teknologi, der gør de gratis Cross-Country reactivity multiplex immunassays bredt tilgængelige for forskere med eksperimentelle grundopsætning. Adskiller sig fra eksisterende antistof microarrays, ingen microarray spotter er nødvendig for slutbrugere. Både enkelt og dobbelt overførselsmetoder er påvist, og dobbelt overførsel giver overlegen justering nøjagtighed ned til ~ 40 μm for 98% steder, med den største fejljustering af 63 µm14. En…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Rob Sladek til brug i inkjet spotter. Vi anerkender den endelige støtte fra den canadiske institutter for sundhed Research (CIHR), naturvidenskabelige og Engineering Research Rådet i Canada (NSERC), canadiske kræft samfund Research Institute og Canada Foundation for Innovation (CFI). D.J. tak støtte fra en Canada forskning stol.
Materials
| Phosphate buffered saline tablet | Fisher Scientific | 5246501EA | |
| Streptavidin-conjugated Cy5 | Rockland | s000-06 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | p1379 | |
| Bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 001-000-162 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer | SurModics, Inc | SG02 | |
| Nitrocellulose coated slides | Grace Bio-Laboratories, Inc | 305116 | |
| Aminosilane coated slides | Schott North America | 1064875 | |
| Snap Device | Parallex BioAssays Inc. | PBA-SD01 | |
| Inkjet microarray spotter | GeSiM | Nanoplotter 2.0 | |
| Slide module gasket | Grace Bio-Laboratories, Inc | 204862 | |
| Humidity Stabilization Beads | Parallex BioAssays Inc. | PBA-HU60 | |
| Array-Pro Analyzer software | Media Cybernetics | Version 4.5 | |
| Fluorescence microarray scanner | Agilent | SureScan Microarray Scanner | |
| Biostatistics software | GraphPad Software | GraphPad Prism 6 | |
| Endoglin capture antibody | R&D Systems | MAB10972 | |
| Endoglin protein | R&D Systems | 1097-EN | |
| Endoglin detection antibody | R&D Systems | BAF1097 | |
| IL-6a (see Table 1) | R&D Systems | ||
| IL-6b (see Table 1) | Invitrogen |
References
- Mor, G., et al. Serum protein markers for early detection of ovarian cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (21), 7677-7682 (2005).
- Nicolini, A., et al. Intensive post-operative follow-up of breast cancer patients with tumour markers: CEA, TPA or CA15.3 vs MCA and MCA-CA15.3 vs CEA-TPA-CA15.3 panel in the early detection of distant metastases. BMC Cancer. 6 (1), 1-9 (2006).
- Hnasko, R., Lin, A., McGarvey, J. A., Stanker, L. H. A rapid method to improve protein detection by indirect ELISA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 410 (4), 726-731 (2011).
- Percy, A. J., Chambers, A. G., Yang, J., Hardie, D. B., Borchers, C. H. Advances in multiplexed MRM-based protein biomarker quantitation toward clinical utility. Biochim. Biophys. Acta – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 917-926 (2014).
- Ekins, R. P. Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal. 7 (2), 155-168 (1989).
- Mahlknecht, P., et al. An antibody microarray analysis of serum cytokines in neurodegenerative Parkinsonian syndromes. Proteome Sci. 10 (1), 71-80 (2012).
- Miller, J. C., et al. Antibody microarray profiling of human prostate cancer sera: Antibody screening and identification of potential biomarkers. Proteomics. 3 (1), 56-63 (2003).
- Li, H., Leulmi, R. F., Juncker, D. Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis. Lab Chip. 11 (3), 528-534 (2011).
- Juncker, D., Bergeron, S., Laforte, V., Li, H. Cross-reactivity in antibody microarrays and multiplexed sandwich assays: shedding light on the dark side of multiplexing. Curr. Opin. Chem. Biol. 18, 29-37 (2014).
- Blank, K., et al. Double-chip protein arrays: force-based multiplex sandwich immunoassays with increased specificity. Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 974-981 (2004).
- Albrecht, C., et al. DNA: A Programmable Force Sensor. Science. 301 (5631), 367-370 (2003).
- Pla-Roca, M., et al. Antibody Colocalization Microarray: A Scalable Technology for Multiplex Protein Analysis in Complex Samples. Mol. Cell. proteomics. 11 (4), (2012).
- Li, H., Bergeron, S., Juncker, D. Microarray-to-Microarray Transfer of Reagents by Snapping of Two Chips for Cross-Reactivity-Free Multiplex Immunoassays. Anal. Chem. 84 (11), 4776-4783 (2012).
- Li, H., Munzar, J. D., Ng, A., Juncker, D. A versatile snap chip for high-density sub-nanoliter chip-to-chip reagent transfer. Sci. Rep. 5, 11688 (2015).
- Li, H., Bergeron, S., Annis, M. G., Siegel, P. M., Juncker, D. Serial analysis of 38 proteins during the progression of human breast tumor in mice using an antibody colocalization microarray. Mol. Cell. Proteomics. 14, 1024-1037 (2015).
- Bergeron, S., Laforte, V., Lo, P. S., Li, H., Juncker, D. Evaluating mixtures of 14 hygroscopic additives to improve antibody microarray performance. Anal. Bioanal. Chem. 407 (28), 8451-8462 (2015).
- Whiteaker, J. R., et al. Sequential Multiplexed Analyte Quantification Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled to Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 11 (6), (2012).
- Xu, K., Wang, X., Ford, R. M., Landers, J. P. Self-Partitioned Droplet Array on Laser-Patterned Superhydrophilic Glass Surface for Wall-less Cell Arrays. Anal. Chem. 88 (5), 2652-2658 (2016).
- Lee, M. -. Y., Park, C. B., Dordick, J. S., Clark, D. S. Metabolizing enzyme toxicology assay chip (MetaChip) for high-throughput microscale toxicity analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (4), 983-987 (2005).
- Fernandes, T. G., et al. Three-dimensional cell culture microarray for high-throughput studies of stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 106 (1), 106-118 (2010).
- Kwon, C. H., et al. Drug-Eluting Microarrays for Cell-Based Screening of Chemical-Induced Apoptosis. Anal. Chem. 83 (11), 4118-4125 (2011).
- Jogia, G. E., Tronser, T., Popova, A. A., Levkin, P. A. Droplet Microarray Based on Superhydrophobic-Superhydrophilic Patterns for Single Cell Analysis. Microarrays. 5 (4), 28 (2016).
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray. Science. 270 (5235), 467-470 (1995).
- Wu, J., et al. A sandwiched microarray platform for benchtop cell-based high throughput screening. Biomaterials. 32 (3), 841-848 (2011).
