Основного состояния истощения суперразрешением изображений в клетках млекопитающих
Summary
Эта статья конспектирует протокол для обнаружения одного или нескольких плазмы и/или внутриклеточные мембранные белки с помощью основного состояния истощения (GSD) суперразрешением микроскопии в mammalian клетках. Здесь мы рассмотрим преимущества и ограничения использования таких подходов для визуализации и количественной оценке клеточных белков.
Abstract
Достижения в флуоресцентной микроскопии и ячейки биологии тесно коррелируются с расширенной способность визуализировать сотовой события часто приводит к драматическим МПДООС в нашем понимании того, как клетки функции. Разработку и наличие суперразрешением микроскопии значительно расширился пределы оптическое разрешение от ~ 250-20 Нм. Биологи больше не ограничивается описанием молекулярных взаимодействий с точки зрения colocalization в пределах дифракции ограниченной области, скорее это теперь можно визуализировать динамического взаимодействия отдельных молекул. Здесь мы приводим протокол для визуализации и количественной оценке клеточных белков на истощение земли государство микроскопии для фиксированной клеток. Мы предлагаем примеры из двух различных мембранных белков, элемент translocon эндоплазматического ретикулума, sec61β и плазматической мембраны локализованных напряжения закрытый L-типа Ca2 + канал (CaV1.2). Обсуждаются конкретные Микроскоп параметры, методы фиксации, Фото переключения буфера формулировки и ловушки и задач обработки изображений.
Introduction
Клеточных сигналов реакции перевод, изменение внутренних и внешних сред клеточный ответ инициировать. Они регулируют все аспекты человеческой физиологии, выступающей в качестве основы для гормонов и нейромедиатора релиз, сердцебиение, видение, оплодотворение и когнитивные функции. Нарушение этих сигнальных каскадов может иметь серьезные последствия в виде патофизиологические условий, включая рак, Паркинсона и болезнь Альцгеймера. На протяжении десятилетий биологических и медицинских следователей успешно использовали флуоресцентных белков, зонды и биодатчиков, в сочетании с микроскопии флуоресцирования как основной инструмент для понимания точной пространственной и временной организации этих сотовых сигналы.
Сильные оптические методы, такие как эпифлуоресцентного, конфокальная, или полное внутреннее отражение микроскопии флуоресцирования (TIRF) являются их чувствительность, скорость и совместимость с живой клетки изображений, в то время как основным ограничением является их невозможно разрешить дифракционный резолюции, смысл структур или белковых комплексов меньше 200-250 Нм. С теоретической и практической разработки детерминированной суперразрешением (например, простимулированное излучение истощения микроскопии (1интереса), структурированных освещения микроскопии (2SIM) или стохастические суперразрешением (например , photoactivated локализации микроскопии (3PALM), или основного состояния истощения (GSD4,,5)), боковой и осевой резолюции в микроскопии флуоресцирования вышла за рамки дифракции барьер, в порядке от несколько десятков нанометров. Таким образом следователи теперь имеют беспрецедентную возможность визуализировать и понять, как динамики белков и организация переводит функцию на около молекулярном уровне.
Основного состояния истощения микроскопии следуют отдельные молекулы возвращение (GSDIM), или просто GSD как известно, обходит дифракционного предела снижая количество одновременно испуская флуорофоров4,5. Высокой энергии лазера используется для возбуждения Флюорофор, меченного образца, бомбардирующих электронов с фотонами и увеличивая вероятность того, они проходят в спин сальто и введите триплет или «темно государство» из возбужденного состояния4. Это эффективно истощает землю государства, отсюда название «землю состояния истощения». В государстве, триплет флуорофоров не излучают фотоны и образца появляется диммер. Однако эти флуорофоров ковшах вернуться в состояние земли и может пройти через несколько фотон, испуская возбужденных Земля состояниями прежде чем вернуться в состояние триплет. С меньше флуорофоров излучающих в любой момент времени, фотон очередей излучаемый отдельных флуорофоров, становятся пространственно и височно отличается от соседних флуорофоров. Всплеск фотонов может быть установлен с функцией Гаусса, расчетный центр тяжести которого соответствует позиции Флюорофор с точностью локализации, которая зависит от числовой апертуры (NA) объектива, длина волны света, используемого для возбуждения и самое главное, количество фотонов, на Флюорофор. GSD ограничение состоит в том, что, поскольку только подмножество флуорофоров активно излучает в любое время, тысячи изображений должны быть собраны за несколько минут, чтобы создать карту полной локализации. Длинные приобретение время, в сочетании с высокой лазерной требования к электической мощности, означает, что УГГК лучше подходит для фиксированной вместо живых образцов.
В этой статье описывается подготовка фиксированной образцов для супер-резолюции микроскопии изображений и мембраны эндоплазматического ретикулума (ER)-резидентов белков (для получения списка необходимых расходных материалов и реагентов просмотреть Таблицу материалов). Примеры как этот протокол может быть легко адаптирована для количественного определения размера и степени кластеризации L-типа условного напряжения Ca2 + каналов (Cav1.2) в сарколеммы культивировании, или используется для визуализации клеточных распределения ER, демонстрируются. Понимание распределения и организации этих клеточных компонентов критически важную роль в понимании возбуждение, перевод и в конечном счете функции многих Ca2 +-зависимые сигнальные каскады. К примеру Cav1.2 каналы являются принципиально важными для возбуждения сокращение муфты, в то время как рецептор опосредованный Ca2 + освобождение от ER является, пожалуй, наиболее распространенным сигнальный Каскад в mammalian клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавний взрыв технологий, которые позволяют изображений за дифракционный предел предложили новые окна в сложности mammalian клетки сигналов в пространстве и времени. Эти технологии включают в себя буря, интереса, PALM, ГСД, SIM и их словоформы (например, dSTORM, FPALM). Изобретательность ученых …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от AHA на R.E.D. (15SDG25560035). Авторы хотели бы признать д-р Фернандо Сантана для использования его 3D микроскоп Leica SR ГСД и доктор Йоханнес ада за любезно предоставление FP1 антитела.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
