الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات
Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول للكشف عن واحد أو أكثر من البلازما أو بروتينات الغشاء داخل الخلايا باستخدام مجهرية فائقة القرار استنزاف الدولة الأرض (GSD) في خلايا الثدييات. وهنا، نحن نناقش المنافع والاعتبارات المتعلقة باستخدام هذه النهج للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية.
Abstract
التقدم في علم الأحياء المجهري وخلية الفلورسنت ارتباطاً وثيقا، مع تعزيز القدرة على تصور الأحداث الخلوية التي غالباً ما تؤدي إلى قفزات هائلة في فهمنا لكيفية الخلايا الدالة. تطوير وتوافر مجهرية فائقة القرار وسعت إلى حد كبير حدود الدقة البصرية من ~ 250–20 نانومتر. علماء الأحياء لم تعد تقتصر على وصف التفاعلات الجزيئية من حيث كولوكاليزيشن ضمن منطقة حيود محدودة، بل من الممكن الآن لتصور التفاعلات الدينامية للجزيئات الفردية. هنا، فإننا مخطط بروتوكول للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية باستنزاف الأرض-دولة مجهرية لتصوير الخلية الثابتة. نحن نقدم أمثلة من بروتينات الغشاء مختلفة اثنين، وعنصر ترانسلوكون هيولى، sec61β، والمترجمة بغشاء البلازما عن طريق بوابة الجهد Ca L من نوع2 + قناة (CaV1.2). وناقش مجهر محددة المعالم، أساليب التثبيت، وتبديل الصورة وضع المخزن المؤقت، والمزالق والتحديات لمعالجة الصور.
Introduction
ترجمة ردود فعل الإشارات الخلوية تغير البيئات الداخلية والخارجية لبدء استجابة خلوية. أنها تنظم جميع جوانب الفسيولوجيا البشرية، كأساس لهرمون وناقل عصبي الإفراج عن نبضات القلب، الرؤية، التسميد، والوظائف المعرفية. يمكن تعطيل هذه الشلالات مما يشير إلى عواقب وخيمة في شكل الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك السرطان، باركنسون، ومرض الزهايمر. على مدى عقود، المحققين البيولوجية والطبية استخدمت بنجاح البروتينات الفلورية والمجسات وأجهزة استشعار العوامل البيولوجية مقترنة بالفحص المجهري الأسفار كأدوات أساسية لفهم المنظمة المكانية والزمانية الدقيقة لهذه الخلايا الإشارات.
نقاط قوة التقنيات البصرية مثل ابيفلوريسسينسي، [كنفوكل]، أو انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية من حساسية، والسرعة، والتوافق مع التصوير خلية حية، في حين أن القيد الرئيسي بهم لا يمكن حل القرار حيود محدودة، وهياكل معنى أو مجمعات البروتين أقل من 200-250 نيوتن متر. مع التطور النظري والعملي للقرار فائقة القطعية (مثلاً، حفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED1)، منظم إضاءة مجهرية (سيم2) أو العشوائية دقة فائقة (مثلاً ، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل3)، أو أرض الدولة نضوب (جيرمن شيبرد4،5))، تم تمديد القرار الأفقي ومحوري في الفحص المجهري الأسفار خارج الحاجز الحيود، بأمر من عشرات نانومتر. وهكذا، أن المحققين لديهم الآن لا مثيل لها القدرة على تصور وفهم كيف يترجم ديناميات البروتين والمنظمة لوظيفة على المستوى الجزيئي بالقرب.
أرض الدولة نضوب مجهرية متبوعاً بالعودة الفردية جزيء (جسديم)، أو ببساطة الديمقراطيين الاشتراكيين كما هو معروف، تلتف الحد حيود بتخفيض العدد من انبعاث فلوروفوريس4،5في وقت واحد. ويستخدم ضوء الليزر ذات الطاقة العالية لتثير عينة المسمى فلوروفوري، قصف الإلكترونات مع الفوتونات وزيادة احتمال أنهم سوف يخضع ‘تدور الوجه’ وأدخل الثلاثي أو ‘الظلام–الدولة’ من الدولة متحمس4. وهذا يستنزف فعالية الدولة الأرض، ومن ثم الاسم ‘البري استنزاف الدولة’. في حالة الثلاثي، فلوروفوريس لا تنبعث الفوتونات والعينة تظهر باهتة. ومع ذلك، هذه فلوروفوريس ستوتشاستيكالي العودة إلى أرض الدولة ويمكن أن تذهب من خلال عدة فوتون انبعاث انتقالات الحالة متحمس للأرض قبل أن تعود إلى الدولة الثلاثي. مع أقل تلويثاً فلوروفوريس في أي وقت من الأوقات، ينبعث فوتون رشقات نارية من fluorophores الفردية تصبح متميزة مكانياً وزمنياً من المجاورة فلوروفوريس. يمكن احتواء انفجار الفوتونات مع وظيفة غاوسي، centroid المحسوب الذي يتوافق مع موقف فلوروفوري مع دقة ترجمة التي تعتمد على (غ) الفتحة العددية للعدسة، والطول الموجي للضوء المستخدم الإثارة، ومن الأهمية بمكان عدد الفوتونات المنبعثة لكل فلوروفوري. واحد الحد من الديمقراطيين الاشتراكيين أنه، نظراً لمجموعة فرعية فقط من فلوروفوريس بنشاط تنبعث منه في أي وقت، يجب جمع آلاف صور خلال عدة دقائق لبناء خريطة كاملة تعريب. الوقت اكتساب طويلة جنبا إلى جنب مع اشتراط ليزر عالية الطاقة، يعني أن الديمقراطيين الاشتراكيين أكثر ملاءمة لثابت بدلاً من عينات حية.
توضح هذه المقالة، إعداد العينات الثابتة لتصوير مجهرية فائقة القرار بغشاء هيولى (ER)-البروتينات المقيم (للحصول على قائمة من المواد الاستهلاكية الضرورية والمواد الكاشفة انظر الجدول للمواد). أمثلة لكيفية هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييفها لقياس حجم ودرجة تجميع لتر من نوع الجهد-قنوات عن طريق بوابة Ca2 + (Cav1.2) في ساركوليما myocytes القلب، أو المستخدمة لتصور توزيع الخلوية للائحة، وأظهرت. فهم توزيع وتنظيم هذه المكونات الخلوية من الأهمية بمكان فهم الشروع، والترجمة، وفي نهاية المطاف الدالة من كاليفورنيا العديد من2 +-تعتمد الشلالات إرسال الإشارات. على سبيل المثال، Cav1.2 القنوات ذات أهمية أساسية للإثارة-تقلص اقتران, بينما ربما بوساطة مستقبلات Ca2 + الإصدار لائحة تتالي إرسال الإشارات في كل مكان آخر في خلايا الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
عرضت التفجير الأخير للتكنولوجيات التي تسمح لتصوير خارج حدود حيود نوافذ جديدة إلى تعقيدات الثدييات الخلية إشارات في الزمان والمكان. وتشمل هذه التكنولوجيات العاصفة، STED والنخيل، والديمقراطيين الاشتراكيين، سيم وأشكالها (مثلاً، دستورم، فبالم). إبداع العلماء وراء هذه التقنيات قد سمح لن?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل بمنحه من اها إلى R.E.D. (15SDG25560035). المؤلف يود أن ينوه الدكتور فرناندو سانتانا لاستخدام مجهر ثلاثي الأبعاد له “إيكا ريال الديمقراطيين الاشتراكيين”، والدكتور يوهانس الجحيم يرجى توفير جسم FP1.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
