Grundtilstand udtynding super-resolution Imaging i pattedyrceller
Summary
Denne artikel omhandler en protokol til påvisning af en eller flere plasma og/eller intracellulære Membranproteiner ved hjælp af grundtilstand udtynding (GSD) super-resolution mikroskopi i pattedyrsceller. Her diskuterer vi fordele og overvejelser til brug af sådanne tilgange til visualisering og kvantificering af cellulære proteiner.
Abstract
Fremskridt i fluorescerende mikroskopi og cellebiologi er tæt korreleret med den forbedrede evne til at visualisere cellulære begivenheder ofte fører til dramatiske spring i vores forståelse af, hvordan celler funktion. Udvikling og tilgængeligheden af super-resolution mikroskopi er betydeligt udvidet grænserne for optisk opløsning fra ~ 250-20 nm. Biologer er ikke længere begrænset til at beskrive molekylære interaktioner med hensyn til colocalization inden for et diffraktion begrænset område, snarere er det nu muligt at visualisere det dynamiske samspil af individuelle molekyler. Her, skitsere vi en protokol til visualisering og kvantificering af cellulære proteiner af ground-state udtynding mikroskopi for faste celle billeddannelse. Vi give eksempler fra to forskellige Membranproteiner, et element i det endoplasmatiske reticulum translocon, sec61β og et plasma membran-lokaliseret spænding-gated L-type Ca2 + -kanal (CaV1.2). Drøftet er specifikke mikroskop parametre, fiksering metoder, foto-switching buffer formulering, og faldgruber og udfordringer af billedbehandling.
Introduction
Cellulær signalering reaktioner oversætte skiftende interne og eksterne miljøer for at initiere en cellulære reaktion. De regulerer alle aspekter af menneskets fysiologi, der tjener som fundament for hormon og neurotransmitter frigivelse, hjerteslag, vision, befrugtning og kognitiv funktion. Afbrydelse af disse signaling cascades kan have alvorlige konsekvenser i form af patofysiologiske forhold, herunder kræft, Parkinsons og Alzheimers sygdom. I årtier, biologiske og medicinske efterforskere har med held brugt fluorescerende proteiner, sonder og biosensorer kombineret med Fluorescens mikroskopi som de primære værktøjer til at forstå den præcise rumlige og tidsmæssige tilrettelæggelse af disse cellulære signaler.
De stærke sider af optiske teknikker såsom epifluorescensmikroskop, Konfokal, eller total interne reflection fluorescens (JOHANNAS) mikroskopi er deres følsomhed, hastighed og kompatibilitet med levende celle imaging, mens den store begrænsning er deres diffraktion-begrænset opløsning, betyder strukturer eller proteinkomplekser mindre end 200-250 nm kan ikke løses. Med den teoretiske og praktiske udvikling af deterministiske super-opløsning (f.eks.stimuleret emission udtynding mikroskopi (STED1), struktureret belysning mikroskopi (SIM2) eller stokastiske super-resolution (f.eks. , photoactivated lokalisering mikroskopi (PALM3) eller grundtilstand udtynding (GSD4,5)), laterale og aksial opløsning i Fluorescens mikroskopi er blevet forlænget ud over diffraktion barriere, at med henblik på snese nanometer. Efterforskere har således nu den enestående evne til at visualisere og forstå, hvordan protein dynamics og organisation oversætter til funktion på nær molekylært niveau.
Grundtilstand udtynding mikroskopi efterfulgt af enkelte molekyle tilbage (GSDIM), eller simpelthen GSD omgår som det er kendt, diffraktion grænse ved at reducere antallet af samtidigt udsender fluorophores4,5. Høj energi laserlys bruges til at vække den fluorophore-mærket prøve, bombardere elektroner med fotoner og øge sandsynligheden for de vil gennemgå en ‘spin-flip’ og Indtast triplet eller “dark-stat” fra exciterede tilstand4. Det dræner effektivt grundtilstand, derfor navnet ‘jorden stat udtynding’. I tilstanden triplet fluorophores udsender ikke fotoner og prøven vises lysdæmper. Men disse fluorophores stochastically tilbage til grundtilstanden og kan gå gennem flere photon udsender ophidset til jord tilstand overgange før vender tilbage til tilstanden triplet. Med mindre fluorophores udsender på et givet tidspunkt, foton byger udsendes fra enkelte fluorophores blive rumligt og tidsligt adskiller sig fra tilstødende fluorophores. Byge af fotoner kan være fit med en Gaussisk funktion, den beregnede barycentrum som svarer til placeringen af fluorophore med en lokalisering præcision, der er afhængige af den numerisk blænde (NA) af linsen, bølgelængde af lys bruges til excitation og afgørende, antallet af fotoner, der udsendes pr. fluorophore. En begrænsning af GSD er, at, da kun en delmængde af fluorophores udsender aktivt til enhver tid, tusindvis af billeder skal indsamles over flere minutter at opbygge en komplet lokalisering kort. Den lange erhvervelse tid kombineret med høje laser magt krav, betyder, at GSD er bedre egnet til at faste i stedet for levende prøver.
Denne artikel beskriver forberedelse af faste prøver for Super-resolution mikroskopi billeddannelse af membranen og endoplasmatiske reticulum (ER)-bosat proteiner (for en liste over nødvendige forbrugsvarer og reagenser Se Tabel af materialer). Eksempler på hvordan denne protokol kan nemt tilpasses for at opgøre størrelsen og graden af klynger afL-type spænding-gated Ca 2 + -kanaler (Cav1,2) i sarcolemma af hjertets myocytes, eller bruges til at visualisere den cellulære fordeling af på Skadestuen, er påvist. Forstå distribution og organisation af disse cellulære komponenter er kritisk vigtigt i at forstå indledning, oversættelse, og i sidste ende funktion af mange Ca2 +-afhængige signaling cascades. For eksempel er Cav1,2 kanaler fundamentalt vigtigt for excitation-sammentrækning kobling, mens receptor-medieret Ca2 + release fra Skadestuen er måske den mest allestedsnærværende signaling kaskade i pattedyrsceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nylige eksplosion af teknologier, der tillader imaging ud over diffraktion grænsen har tilbudt nye vinduer i kompleksiteten af pattedyr celle signalering i tid og rum. Disse teknologier omfatter STORM, STED, PALM, GSD, SIM, og deres varianter (fx, dSTORM, FPALM). Opfindsomhed af forskerne bag disse teknikker har tilladt os at omgå de begrænsninger af lovene i fysik for diffraktion af lys. Trods denne store realisering, hver af disse teknikker gør en form for kompromis for at opnå super-opløsning og som…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra AHA til redsector (15SDG25560035). Forfatterne vil gerne anerkende Dr. Fernando Santana for brug af hans Leica SR GSD 3D mikroskop, og Dr. Johannes Hell venligst give FP1 antistof.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
