Grundzustand Erschöpfung Super-Resolution Imaging in Säugerzellen
Summary
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von einem oder mehreren Plasma und/oder intrazellulären Membranproteinen mit Grundzustand Erschöpfung (GSD) Super-Auflösung Mikroskopie in Säugerzellen. Hier besprechen wir die Vorteile und die Überlegungen der Verwendung solcher Ansätze zur Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen.
Abstract
Fortschritte in der Fluoreszenz-Mikroskopie und Zellbiologie korrelieren eng mit der verstärkten Fähigkeit zu visualisieren, zelluläre Ereignisse führt häufig zu dramatischen Sprünge in unserem Verständnis, wie Zellen funktionieren. Die Entwicklung und Verfügbarkeit der Höchstauflösung Mikroskopie wurde erheblich erweitert die Grenzen der optischen Auflösung von ~ 250-20 nm. Biologen sind nicht mehr nur auf die Beschreibung der molekularer Interaktionen in Bezug auf NS1 innerhalb eines Bereichs von Beugung begrenzt, sondern es ist nun möglich, die dynamischen Wechselwirkungen einzelner Moleküle zu visualisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Visualisierung und Quantifizierung von zellulären Proteinen Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie für feste Zelle Bildgebung. Wir bieten Beispiele aus zwei verschiedenen Membranproteinen, Bestandteil des endoplasmatischen Retikulum Translocon, sec61β undeiner Plasmamembran lokalisiert Voltage-gated Typ L Ca 2 + -Kanäle (CaV1.2). Diskutiert werden spezifische Mikroskop Parameter, Fixierung Methoden, Foto-Umschaltung Puffer Formulierung und Fallstricke und Herausforderungen der digitalen Bildverarbeitung.
Introduction
Zelluläre Reaktionen Signalisierung übersetzen wechselnde interne und externe Umgebungen um eine zelluläre Reaktion zu initiieren. Sie regelt alle Aspekte der menschlichen Physiologie, dienen als Grundlage für Hormon und Neurotransmitter-Freisetzung, der Herzschlag, Vision, Düngung und kognitive Funktion. Störung der diese Signalisierung Kaskaden kann gravierende Folgen in Form von pathophysiologischen Bedingungen wie Krebs, Parkinson und Alzheimer-Krankheit haben. Jahrzehntelang haben biologischer und medizinischer Forscher erfolgreich fluoreszierende Proteine, Sonden und Biosensoren gepaart mit Fluoreszenz-Mikroskopie als die wichtigsten Tools verwendet, um die genaue räumliche und zeitliche Organisation dieser zelluläre verstehen Signale.
Die Stärken des optischen Techniken wie Epifluoreszenz, konfokale, oder Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) sind ihre Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Kompatibilität mit live Cell imaging, während die große Einschränkung ist ihre Beugung begrenzte Auflösung, Bedeutung Strukturen oder Proteinkomplexe, die kleiner als 200-250 nm können nicht aufgelöst werden. Mit der theoretischen und praktischen Entwicklung von deterministischen Höchstauflösung (z.B.stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED-1), strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM2) oder stochastische Höchstauflösung (z.B. , photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM3) oder Grundzustand Erschöpfung (GSD4,5)), laterale und axiale Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie erweitert darüber hinaus die Beugung Barriere zu Gunsten von Dutzende von Nanometern. So haben Ermittler nun die unvergleichliche Fähigkeit zu visualisieren und zu verstehen, wie Proteindynamik und Organisation Funktion auf in der Nähe von molekularer Ebene übersetzt.
Grundzustand Erschöpfung Mikroskopie gefolgt von einzelnen Molekül zurück (GSDIM) oder einfach GSD umgeht wie es bekannt ist, die Beugungsgrenze durch Reduzierung der Anzahl der gleichzeitig emittierende Fluorophore4,5. Hochenergie-Laser-Licht wird zur begeistern der Fluorophore beschriftet Probe, bombardieren Elektronen mit Photonen und erhöhen die Wahrscheinlichkeit sie unterziehen einen “Spin-Flip” und geben Sie die Triole oder “Dark-Staat” aus dem angeregten Zustand4. Dies verbraucht effektiv den Grundzustand, daher der Name “Boden stand Erschöpfung”. Im Triplett-Zustand Fluorophore emittieren keine Photonen und die Probe erscheint dunkler. Jedoch diese Fluorophore stochastisch in den Grundzustand zurück und können durch mehrere Photonen emittieren aufgeregt Grundzustand Übergänge vor der Rückkehr in den Triplett-Zustand gehen. Mit weniger Fluorophore aussenden zu einem bestimmten Zeitpunkt, Photon platzt aus einzelnen Fluorophore werden räumlich und zeitlich voneinander benachbarte Fluorophore emittiert. Das Platzen der Photonen kann mit einer Gaußschen Funktion, fit sein, die Position der Fluorophor mit einer Genauigkeit der Lokalisierung der berechneten Schwerpunkt davon, die abhängig von der numerischen Apertur (NA) des Objektivs, die Wellenlänge des Lichts verwendet entspricht für Erregung und entscheidend ist, die Anzahl der Photonen pro Fluorophor. Eine Einschränkung der GSD ist, dass da nur eine Teilmenge der Fluorophore aktiv jederzeit abgibt, Tausende von Bildern über mehrere Minuten zum Aufbau einer vollständigen Lokalisierung Karte gesammelt werden müssen. Die lange Erfassungszeit kombiniert mit der hohen Laser Leistungsbedarf bedeutet, dass GSD besser repariert anstatt live Proben geeignet ist.
Dieser Artikel beschreibt die Vorbereitung von festen Proben für die Höchstauflösung Mikroskopie Bildgebung der Membrane und das endoplasmatische Retikulum (ER)-resident Proteine (für eine Liste der notwendigen Verbrauchsmaterialien und Reagenzien siehe Tabelle of Materials). Beispiele wie dieses Protokolls leicht angepasst, um die Größe und Grad der Cluster-Bildung von L-Typ Voltage-gated Ca2 + -Kanäle (CaV1.2) in das Sarkolemm von kardialen Myozyten zu quantifizieren, oder verwendet werden kann, die zelluläre Verteilung von der Notaufnahme zu visualisieren, werden demonstriert. Verständnis für die Verteilung und Organisation dieser zellulären Komponenten ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Einleitung, Übersetzung und letztlich die Funktion der vielen Ca2 +-abhängige Signalisierung Kaskaden. Zum Beispiel sind CaV1.2 Kanäle für Erregung-Kontraktion Kupplung, während Rezeptor-vermittelte Ca2 + Entlassung aus der ER vielleicht die allgegenwärtige Signalkaskade in Säugetierzellen ist grundlegend wichtig.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die jüngste Explosion von Technologien, mit denen Bildgebung jenseits der Beugungsgrenze haben neue Fenster in die Komplexität der Säugetier-Zelle signalisieren in Raum und Zeit angeboten. Diese Technologien sind Sturm, STED, PALM, GSD, SIM und ihre Varianten (z.B. dSTORM, FPALM). Der Einfallsreichtum der Wissenschaftler hinter diesen Techniken ermöglichte uns, die Beschränkungen durch die Gesetze der Physik für die Beugung von Licht zu umgehen. Trotz dieser großen Leistung jede dieser Techniken macht ein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der AHA an R.E.D (15SDG25560035) unterstützt. Autoren möchten Dr. Fernando Santana für den Einsatz des Mikroskops seiner Leica SR GSD-3D und Dr. Johannes Hell für die freundlicherweise Bereitstellung des FP1 Antikörpers erkennen.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
