הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית
Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור של אחד או יותר פלזמה ו/או חלבונים תאיים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע (GSD) בתאי יונקים. כאן, אנו נדון את היתרונות ואת השיקולים של שימוש בגישות כאלה עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים.
Abstract
ההתקדמות פלורסנט מיקרוסקופ ביולוגיה של התא הם אישית בקורלציה, עם משופרת היכולת לדמיין את הסלולר אירועים מובילים לעתים קרובות כדי קפיצות דרמטי בהבנתנו כיצד תאים פונקציה. פיתוח, הזמינות של מיקרוסקופ סופר-ברזולוציה במידה ניכרת האריך את הגבולות של רזולוציה אופטית מ ~ 250-20 ננומטר. ביולוגים מוגבלים יותר לתיאור אינטראקציות מולקולרית במונחים של colocalization בתוך אזור עקיפה מוגבלת, אלא זה עכשיו אפשר לדמיין את האינטראקציות דינמי של מולקולות בודדות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות עבור ויזואליזציה של כימות של החלבונים פרוטוקול על ידי מיקרוסקופ הקרקע-מצב דלדול לדימות תא קבוע. אנו מספקים דוגמאות מתוך שני חלבונים ממברנה שונים, אבן יסוד של translocon רשתית תוך-פלזמית sec61β, מותאם לשפות אחרות קרום פלזמה ממותגת מתח Ca L-סוג2 + ערוץ (CaV1.2). דנו הם פרמטרים ספציפיים מיקרוסקופ, שיטות קיבוע, מיתוג צילום מאגר ניסוח, ואת החסרונות אתגרים של עיבוד תמונה.
Introduction
תגובות איתות סלולרי לתרגם שינוי סביבות פנימיים וחיצוניים ליזום תגובה תאית. הם לווסת את כל ההיבטים של פיזיולוגיה אנושית, הגשה הקרן הורמון שחרור נוירוטרנסמיטר, פעימות הלב, חזון, הפריה, ואת התפקוד הקוגניטיבי. שיבוש cascades איתות אלה יכולות להיות השלכות חמורות בצורה של תנאים הקשורים pathophysiological כולל סרטן, פרקינסון, אלצהיימר. במשך עשורים, ביולוגי ורפואי החוקרים השתמשו בהצלחה חלבונים פלורסנט הגששים, ביולוגיים בשילוב עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ כמו הכלים הראשי כדי להבין את ארגון יכולות מדויקות מאלה הסלולר אותות.
נקודות החוזק של טכניקות אופטית כגון epifluorescence, וידאו, או מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (TIRF) גמורה הם שלהם רגישות, מהירות ותאימות עם תא חי הדמיה, אמנם המגבלה העיקרית שלהם רזולוציה מוגבלת עקיפה, משמעות מבנים או חלבון מתחמי קטן מ- 200-250 ננומטר לא יכול להיפתר. עם התפתחות דטרמיניסטית סופר-רזולוציה עיוני ומעשי (תאורה מיקרוסקופ (SIM2) או רזולוציה סופר סטוכסטי מובניםלמשלמיקרוסקופ דלדול פליטה מאולצת (STED1), (למשל , photoactivated לוקליזציה מיקרוסקופ (דקל3), או מצב הקרקע דלדול (GSD4,5)), רזולוציית לרוחב ו צירית במיקרוסקופ פלורסצנטיות הוארך מעבר למכשול עקיפה, על מנת של עשרות ננומטר. לכן, חוקרים עכשיו יש את היכולת לדמיין ולהבין איך חלבון הדינמיקה והארגון מתרגמת לתפקד ברמה ליד-המולקולרית ללא תחרות.
בקרקע דלדול מיקרוסקופ ואחריו החזרה בודדים מולקולה (GSDIM), או פשוט GSD כפי שהיא מכונה, עוקף את מגבלת עקיפה על-ידי הפחתת מספר בו זמנית פליטת4,fluorophores5. אור לייזר באנרגיה גבוהה משמש כדי לרגש המדגם מתויג fluorophore, להפגיז אלקטרונים עם פוטונים, להגדיל את ההסתברות הם עוברים ‘ספין-סלטה’, הזן את שלישיה או “כהה-המדינה” מ- עירור4. זה יעיל מכלה את מצב הקרקע, ומכאן השם ‘קרקע המדינה דלדול’. המדינה שלישיה, fluorophores פולט פוטונים, הדוגמה מופיעה דימר. עם זאת, אלה fluorophores stochastically להחזיר למצב קרקע, יכול לעבור מספר הפוטונים פולטות מעברים למצב נרגש-קרקע לפני החזרה למצב שלישיה. עם פחות fluorophores פולטות בכל זמן נתון, הנפלטים פוטון התפרצויות בודדות fluorophores להיות במרחב של חנותם ברורים ממחוז fluorophores. פרץ זה של פוטונים יכול להיות בכושר עם פונקציה לפי עקומת גאוס, centroid מחושב אשר מתאים למיקום של fluorophore עם דיוק לוקליזציה התלויים מספרי הצמצם (NA) של העדשה, אורך הגל של האור משמש עירור, ויותר חשוב, המספר של פוטונים הנפלט fluorophore. מגבלה אחת של GSD היא כי, מאז רק ערכת משנה של fluorophores פולט באופן פעיל בכל עת, אלפי תמונות יש לאסוף במשך מספר דקות כדי לבנות את מפת לוקליזציה מלאה. בזמן רכישת זמן בשילוב עם הדרישה כוח לייזר גבוהה, המשמעות GSD היא יותר מתאימה לתקן במקום דגימות בשידור חי.
מאמר זה, מתאר את הכנת דוגמאות קבועות עבור הדמיה סופר-ברזולוציה מיקרוסקופיה של הממברנה, תוך-פלזמית (ER)-תושב חלבונים (לקבלת רשימה של מתכלים הדרושים ולראות ריאגנטים טבלה של חומרים). דוגמאות איך פרוטוקול זה ניתן בקלות הותאם לכמת את גודל ואת מידת קיבוץ באשכולות של L-סוג ממותגת מתח Ca2 + ערוצים (Cav1.2) sarcolemma של תאי שריר הלב, או להשתמש כדי להמחיש את ההפצה הסלולר של חדר המיון, הם הפגינו. הבנת את התפלגות וארגון מרכיבים אלה הסלולר היא חשובה ביותר בהבנת הקבלה, תרגום, ובסופו של דבר את הפונקציה של Ca רבים2 +-מפלי איתות התלויים. לדוגמה, Cav1.2 ערוצי חשובים באופן מהותי עבור צימוד, בעוד קולטן בתיווך Ca2 + השחרור מחדר המיון הוא אולי המפל איתות ביותר בכל מקום בתאים בתרבית של עירור-התכווצות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפיצוץ האחרונות של טכנולוגיות המאפשרות הדמיה מעבר למגבלת עקיפה הציעו חלונות חדשים לתוך המורכבות של בתרבית של תאים איתות במרחב ובזמן. טכנולוגיות אלה כוללים סערה, STED, דקל, GSD, SIM, גרסאות שונות (למשל, dSTORM, FPALM). החכמה של המדענים מאחורי טכניקות אלה אפשרה לנו לעקוף את המגבלות שהוטלו על ידי חוק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של AHA כדי R.E.D. (15SDG25560035). מחברים רוצה להכיר ד ר סנטנה פרננדו לשימוש של מיקרוסקופ 3D שלו לייקה SR GSD. ולעזאזל ד ר יוהנס בחביבות לספק הנוגדן FP1.
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit. JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
- Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving. Phys Rev Lett. 98 (21), 218103 (2007).
- Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (58), e3302 (2011).
- Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging. FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).
- Dempsey, G. T., et al. Photoswitching mechanism of cyanine dyes. J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy. PLoS One. 11 (7), e0158884 (2016).
- Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization. Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).
- Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies. Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).
- Dixon, R. E., et al. Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels. Elife. 4, (2015).
- Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
- Nan, X., et al. Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).
- Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy. Sci Rep. 5, 14072 (2015).
