स्तनधारी कोशिकाओं में जमीन राज्य घट सुपर संकल्प इमेजिंग
Summary
यह लेख एक या एक से अधिक प्लाज्मा और/या intracellular झिल्ली प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा जमीन राज्य घट (GSD) स्तनधारी कोशिकाओं में सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर । यहां, हम दृश्य और सेलुलर प्रोटीन के ठहराव के लिए इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग करने के लाभों और विचार पर चर्चा ।
Abstract
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और सेल जीव विज्ञान में अग्रिमों परिचित सेलुलर घटनाओं अक्सर कैसे कोशिकाओं के कार्य की हमारी समझ में नाटकीय छलांग के लिए अग्रणी कल्पना करने के लिए बढ़ाया क्षमता के साथ, संबंधित हैं । विकास और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की उपलब्धता काफी ~ 250-20 एनएम से ऑप्टिकल संकल्प की सीमा बढ़ा दिया है । जीव अब एक विवर्तन सीमित क्षेत्र के भीतर colocalization के संदर्भ में आणविक बातचीत का वर्णन करने के लिए सीमित हैं, बल्कि यह अब व्यक्तिगत अणुओं के गतिशील बातचीत कल्पना करने के लिए संभव है । यहां, हम निश्चित सेल इमेजिंग के लिए जमीन-राज्य घट माइक्रोस्कोपी द्वारा दृश्य और सेलुलर प्रोटीन के ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा । हम दो अलग झिल्ली प्रोटीन, endoplasmic जालिका translocon, sec61β, और एक प्लाज्मा झिल्ली-स्थानीयकृत वोल्टेज-gated एल प्रकार ca2 + चैनल (caV१.२) के एक तत्व से उदाहरण प्रदान करते हैं । चर्चा विशिष्ट माइक्रोस्कोप मापदंडों, निर्धारण तरीके, फोटो स्विचन बफर निर्माण, और नुकसान और छवि प्रसंस्करण की चुनौतियों का सामना कर रहे हैं ।
Introduction
सेलुलर संकेत प्रतिक्रियाओं आंतरिक और बाह्य वातावरण बदलने के लिए एक सेलुलर प्रतिक्रिया शुरू अनुवाद । वे मानव शरीर क्रिया विज्ञान के सभी पहलुओं को विनियमित, हार्मोन और न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई के लिए नींव के रूप में सेवारत, दिल की धड़कन, दृष्टि, निषेचन, और संज्ञानात्मक समारोह. इन संकेतन कैस्केडिंग के विघटन से कैंसर, पार्किंसंस, और अल्जाइमर रोग सहित pathophysiological शर्तों के रूप में गंभीर परिणाम हो सकते हैं । दशकों के लिए, जैविक और चिकित्सा जांचकर्ताओं को सफलतापूर्वक फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जांच का इस्तेमाल किया है, और प्राथमिक उपकरणों के रूप में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ मिलकर जैव संवेदी इन सेलुलर के सटीक स्थानिक और लौकिक संगठन को समझने के लिए संकेतों.
ऐसे epifluorescence, फोकल, या कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी के रूप में ऑप्टिकल तकनीक की ताकत है उनकी संवेदनशीलता, गति, और लाइव सेल इमेजिंग के साथ संगतता, जबकि प्रमुख सीमा है उनके विवर्तन-सीमित संकल्प, अर्थ संरचनाओं या प्रोटीन परिसरों से छोटे 200-250 एनएम हल नहीं किया जा सकता है । नियतात्मक सुपर संकल्प के सैद्धांतिक और व्यावहारिक विकास के साथ (जैसे, प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED1), संरचित दीप्ति माइक्रोस्कोपी (सिम2) या stochastic सुपर संकल्प (उदा. , photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम3), या जमीन राज्य घट (GSD4,5)), पार्श्व और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में अक्षीय संकल्प विवर्तन बाधा से परे बढ़ाया गया है, के आदेश के लिए दसियों nanometers. इस प्रकार, अब जांचकर्ताओं को कल्पना और समझ कैसे प्रोटीन गतिशीलता और संगठन के निकट आणविक स्तर पर समारोह में अनुवाद करने के लिए अद्वितीय क्षमता है ।
जमीन राज्य कमी व्यक्तिगत अणु वापसी (GSDIM), या बस GSD के रूप में यह जाना जाता है के बाद माइक्रोस्कोपी, एक साथ fluorophores4उत्सर्जक की संख्या को कम करने के द्वारा विवर्तन सीमा को दरकिनार,5. उच्च ऊर्जा लेजर प्रकाश fluorophore-लेबल नमूना उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, फोटॉनों के साथ इलेक्ट्रॉनों बमबारी और संभावना वे एक ‘ स्पिन-फ्लिप ‘ से गुजरना और triplet या ‘ डार्क-राज्य ‘ से उत्तेजित राज्य4में प्रवेश करेंगे बढ़ रही है । यह प्रभावी ढंग से जमीनी राज्य को चूस रहा है, इसलिए नाम ‘ जमीन राज्य घट ‘. triplet अवस्था में, fluorophores नहीं उत्सर्जन फोटॉनों और नमूना dimmer दिखाई देता है । हालांकि, इन fluorophores stochastically जमीन राज्य के लिए वापस और कई फोटॉन उत्सर्जित करने वाली जमीन राज्य संक्रमण triplet राज्य में लौटने से पहले उत्सर्जन के माध्यम से जा सकते हैं । कम किसी भी समय उत्सर्जन fluorophores के साथ, फोटॉन व्यक्तिगत fluorophores से उत्सर्जित फटने स्थानिक और अस्थाई पड़ोसी fluorophores से अलग हो जाते हैं । फोटॉनों के फट एक गाऊसी समारोह के साथ फिट हो सकता है, जो की गणना की केन्द्रक एक स्थानीयकरण परिशुद्धता के साथ fluorophore की स्थिति के अनुरूप है कि लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (ना) पर निर्भर है, प्रकाश की तरंग दैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया उत्तेजना और महत्वपूर्ण रूप से, प्रति fluorophore उत्सर्जित फोटॉनों की संख्या । GSD की एक सीमा है कि, के बाद से ही fluorophores का एक सबसेट सक्रिय रूप से किसी भी समय उत्सर्जन करता है, छवियों के हजारों कई मिनट से अधिक एकत्र किया जाना चाहिए करने के लिए एक पूरा स्थानीयकरण नक्शा का निर्माण । लंबे समय अधिग्रहण उच्च लेजर शक्ति की आवश्यकता के साथ संयुक्त, इसका मतलब है कि GSD बेहतर रहने के नमूनों के बजाय तय करने के लिए अनुकूल है ।
यह लेख, झिल्ली और endoplasmic जालिका के सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए तय नमूनों की तैयारी का वर्णन (एर)-निवासी प्रोटीन (आवश्यक उपभोग्य सामग्रियों की एक सूची और रिएजेंट के लिए सामग्री की तालिकादेखें) । इस प्रोटोकॉल के उदाहरण कैसे आसानी से आकार और एल प्रकार वोल्टेज के clustering के डिग्री-gated ca2 + चैनल (cav१.२) कार्डियक myocytes के sarcolemma में, या उपयोग के सेलुलर वितरण कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है एर, प्रदर्शन कर रहे हैं । इन सेलुलर घटकों के वितरण और संगठन को समझना अत्यंत महत्वपूर्ण है दीक्षा, अनुवाद को समझने में, और अंततः कई Ca के समारोह2 +-निर्भर संकेत कैस्केडिंग । उदाहरण के लिए, cav१.२ चैनल उत्तेजना-संकुचन युग्मन के लिए मौलिक रूप से महत्वपूर्ण हैं, जबकि रिसेप्टर से मध्यस्थता2 + रिलीज एर शायद स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे सर्वव्यापी संकेत झरना है ।
Protocol
1. वाशिंग ग्लास Coverslips दिन से पहले नमूना प्रसंस्करण, साफ #1 .5 ग्लास Coverslips द्वारा 1 एच के लिए 1 M समाधान KOH में sonicating । इस coverslips. पर मौजूद हो सकता है कि किसी भी फ्लोरोसेंट दूषित पदार्थों को हटा अच्छी तरह …
Representative Results
Discussion
प्रौद्योगिकियों कि विवर्तन सीमा से परे इमेजिंग की अनुमति के हाल के विस्फोट अंतरिक्ष और समय में संकेतन स्तनधारी सेल की जटिलताओं में नई खिड़कियों की पेशकश की है । इन प्रौद्योगिकियों में तूफान, STED, पाम, GSD, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आहा से R.E.D. (15SDG25560035) तक अनुदान द्वारा समर्थित था । लेखक अपने Leica SR GSD 3 डी माइक्रोस्कोप के उपयोग के लिए dr. फर्नांडो संतांना स्वीकार करना चाहते हैं, और डॉ जोहांस नरक कृपया FP1 एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए ।
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
References
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