哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング
Summary
この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々 は利点およびそのようなアプローチを使用して可視化と細胞蛋白質の定量化のための考慮事項について説明します。
Abstract
強化に、蛍光顕微鏡、細胞生物学の進歩が密接に関連付けられる方法の私達の理解の劇的な飛躍につながる携帯電話のイベントを視覚化する機能細胞機能。超解像顕微鏡法の普及や開発がかなり ~ 250 20 から光学分解能の限界を拡張 nm。生物学者は、もはや回折限界領域内の共存の観点から分子間相互作用を記述する限られた、むしろそれは個々 の分子の動的な相互作用を視覚化することが可能です今。ここでは、我々 は固定細胞イメージングのための地上州枯渇顕微鏡による可視化と細胞蛋白質の定量化のプロトコルを概説します。我々 は 2 つの異なる膜タンパク質は、小胞体トランスロコン、sec61β、および細胞膜局在電位依存性 L 型 Ca2 +チャネル (CaV1.2) 要素からの例を提供します。議論は、特定の顕微鏡のパラメーター、固定方法、光スイッチング バッファーの定式化と落とし穴と画像処理の課題。
Introduction
細胞内シグナル伝達反応は、細胞応答を開始する内部および外部環境の変化を変換します。彼らは、ホルモン、伝達物質の放出、ハートビート、ビジョン、受精、そして認知機能のための基礎として、人間の生理機能のすべての側面を調節します。これらのシグナル伝達カスケードの混乱は、がん、パーキンソン病、アルツハイマー病などの病態生理学的条件の形で深刻な影響を持つことができます。何十年も、生物的および医学研究者使用している正常に蛍光蛋白質、プローブ、およびプライマリ ツールとして蛍光顕微鏡と相まってバイオ センサー細胞のこれらの精密な時空構造を理解するには通知します。
落射蛍光、共焦点、または内部全反射 (TIRF) 蛍光顕微鏡などの光学技術の強みは、その感度、速度、および生細胞イメージング、主要な制限は、互換性の回折限界解像度、意味構造または 200-250 nm より小さい蛋白質の複合体を解決できません。確定的な超解像の理論と実践の開発 (例えば、誘導放出の枯渇顕微鏡 (STED1) 構造化照明顕微鏡を用いて (SIM2) または確率超解像 (など、センサー局在基底状態や顕微鏡 (パーム3) 枯渇 (GSD4,5))、蛍光顕微鏡で曲げ・軸方向の解像度は、のために回折の障壁を超えて拡張されています。数十ナノメートル。したがって、調査官は今、視覚化し、タンパク質のダイナミクスと組織に近く分子レベルで関数に変換する方法を理解する比類のない能力を持っています。
知られているでは基底状態の枯渇顕微鏡戻り個々 の分子が続く (GSDIM) または単に GSD、fluorophores が付いて4,5を同時に発光の数を減らすことによって回折限界を回避します。高エネルギー レーザー光を使用して、励起蛍光ラベル サンプル、光子と電子の砲撃と確率 ‘スピン反転’ を受ける、4励起状態から三重項または ‘暗状態’ を入力します。これは効果的に基底状態を使い果たす、それ故に名前「地上州枯渇’。三重項状態のフルオロは光子を放出しないし、サンプルが暗く表示されます。ただし、これら fluorophores が付いては確率的基底状態に戻り、三重項状態に戻る前に地上へ励起状態の遷移を発光いくつかの光子を行くことができます。以下の同時発光任意の時点で、フォトン バースト個々 fluorophores が付いて fluorophores の近隣から時空間明確化から作成されます。光子のバーストは、ガウス関数の場合、定位精度に使用される光の波長、レンズの開口 (数 NA) に依存するいると蛍光体の位置に対応する計算された重心と合うことが励起と重大、fluorophore あたりのフォトンの数です。GSD の制限の 1 つは、fluorophores のサブセットのみをいつでも積極的に出力するので画像の数千人は、完全なローカリゼーション マップを作成するのに数分以上収集する必要があります。高レーザー電源要件と組み合わせて長い集録時間は、GSD ライブ サンプルではなく固定に適して ことを意味します。
この資料では、超解像顕微鏡イメージング膜と小胞体 (ER) のため固定サンプルの準備を記述する-(必要な消耗品や試薬を参照テーブルの材料のリスト) の居住者のタンパク質。このプロトコルことができます簡単に適応サイズと L 型電位依存性 Ca2 +チャネル (Cav1.2) 心臓 myocytes のモルモットでのクラスタ リングの程度を定量化するまたは、小胞体の細胞の分布を視覚化するために使用する方法の例示されています。分布とこれらの細胞成分の組織を理解することが開始、翻訳、および最終的に多く Ca2 +の機能を理解する上で非常に重要な-依存シグナル伝達カスケード。たとえば、Cav1.2 チャネル、興奮収縮連関、受容体を介した小胞体から Ca2 +放出はおそらく哺乳類細胞で最もユビキタス シグナル伝達カスケードの根本的に重要です。
Protocol
Representative Results
Discussion
回折限界を超えたイメージングを可能にする技術の最近の爆発は、哺乳類細胞の空間と時間におけるシグナル伝達の複雑さに新しいウィンドウを提供しています。これらのテクノロジには、嵐、STED、パーム、GSD、SIM、亜種 (例えばdSTORM、FPALM) が含まれます。これらの技術の背後にある科学者たちの創意工夫は、光の回折現象を支配する物理学の法則によって課された制限を回避するた…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、R.E.D. (15SDG25560035) に、AHA からの助成金によって支えられました。著者は、彼のライカ SR GSD 3 D 顕微鏡の使用のための博士フェルナンド ・ サンタナと FP1 抗体を提供する親切博士ヨハネス ・地獄を認めたいと思います。
Materials
| KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
| #1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
| 10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
| Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
| DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
| Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
| 0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
| Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
| 100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
| SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
| Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
| Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
| Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
| Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
| Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
| beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
| NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
| Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
| Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
| Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
| sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
| Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
| ImageJ | |||
| Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
| Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
| Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |
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