Este artículo describe un protocolo para la detección de uno o más de plasma y proteínas de la membrana intracelular mediante microscopía de superresolución estado agotamiento (GSD) en células de mamíferos. Aquí, discutimos las ventajas y consideraciones del uso de estos enfoques para la visualización y cuantificación de proteínas celulares.
Avances en biología celular y microscopía fluorescente se correlacionan íntimamente con la mayor habilidad de visualizar eventos celulares conduce a menudo a dramáticos saltos en nuestra comprensión de cómo las células de función. El desarrollo y la disponibilidad de la microscopía de superresolución ha ampliado considerablemente los límites de la resolución óptica de ~ 250-20 nm. Biólogos no se limitan a describir las interacciones moleculares en términos de colocalización dentro de un área de difracción limitada, más bien ahora es posible visualizar las interacciones dinámicas de las moléculas individuales. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de proteínas celulares por microscopia de agotamiento de la tierra-estado para la proyección de imagen fija de la célula. Proporcionamos ejemplos de dos proteínas de membrana diferentes, un elemento de la translocon del retículo endoplásmico, sec61β y un localizado en membrana del plasma voltaje tipo L de Ca2 + canal (CaV1.2). Discutidos son el microscopio específicos parámetros, métodos de fijación, cambio de foto formulación del buffer y trampas y desafíos de procesamiento de imágenes.
Reacciones de señalización celulares traducen cambiando los entornos internos y externos para iniciar una respuesta celular. Regulan todos los aspectos de la fisiología humana, sirviendo como la Fundación de hormonas y liberación de neurotransmisor, del latido del corazón, visión, fertilización y función cognitiva. La interrupción de estas cascadas de señales puede tener consecuencias graves en forma de condiciones fisiopatológicas, incluyendo cáncer, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Durante décadas, los investigadores biológicos y médicos han utilizado con éxito proteínas fluorescentes, sondas y biosensores juntados con microscopía de fluorescencia como las herramientas principales para comprender la organización espacial y temporal precisa de estos celulares señales.
Las fuerzas de técnicas ópticas como epifluorescencia, confocal, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total son su sensibilidad, velocidad y compatibilidad con imágenes de células vivas, mientras que la mayor limitación es su difracción limitada resolución y las estructuras de significado o complejos de la proteína menores de 200-250 nm no se puede resolver. Con el desarrollo teórico y práctico de super-resolución determinista (estructurap. ej., microscopia de agotamiento estimulante de la emisión (STED1), microscopía de iluminación (SIM2) o estocástico super-resolución (p. ej. , fotoactiva localización microscopia (3de la palma), o estado el agotamiento (GSD4,5)), resolución lateral y axial en microscopía de fluorescencia se ha extendido más allá de la barrera de la difracción, a la orden de decenas de nanómetros. Así, los investigadores tienen ahora la capacidad sin precedentes para visualizar y entender cómo organización y dinámica de proteínas se traduce en función a nivel molecular cerca.
Microscopia de agotamiento de estado seguido por cada molécula de retorno (GSDIM), o simplemente GSD como se le conoce, evita el límite de difracción reduciendo el número de fluoróforos4,5al mismo tiempo que emite. Luz laser de la alta energía se utiliza para excitar la muestra marcada con el fluoróforo, bombardeo de electrones con fotones y aumentando la probabilidad de que se someten a un ‘spin-flip’ y entrar en el trío o ‘estado de oscuro’ desde el estado excitado4. Esto efectivamente reduce el estado, por lo tanto el nombre de ‘tierra de agotamiento del estado’. En el estado de triplete, fluoróforos no emiten fotones y la muestra aparece más dévil. Sin embargo, estos fluoróforos estocástico regreso al estado base y se pueden pasar por varios fotones emitiendo las transiciones de estado excitado a tierra antes de regresar al estado de triplete. Con menos fluoróforos que emiten en un momento dado, ráfagas del fotón emitieron por fluoróforos individuales se convierten en espacial y temporal distinto de los vecinos de fluoróforos. La ráfaga de fotones se puede caber con una función Gaussiana, el centroide calculado que corresponde a la posición del fluoróforo con una precisión de localización que depende de la apertura numérica (NA) de la lente, la longitud de onda de la luz utilizada para excitación y crucial, el número de fotones emitidos por el fluoróforo. Una limitación de GSD es que, puesto que sólo un subconjunto de fluoróforos emite activamente en cualquier momento, miles de imágenes deben recogerse durante varios minutos para construir un mapa de localización completa. El tiempo de adquisición largo combinado con el requisito de energía láser de alta, significa que GSD mejor se adapta a fijo en lugar de muestras vivas.
Este artículo describe la preparación de muestras fijadas para obtener imágenes de microscopía de superresolución de membrana y el retículo endoplásmico (ER)-proteínas residentes (para una lista de reactivos véase Tabla de materialesy consumibles necesarios). Ejemplos de cómo este protocolo puede ser fácilmente adaptado para cuantificar el tamaño y el grado de agrupamiento de tipo L canales voltaje-bloqueados Ca2 + (Cav1.2) en el sarcolema de los miocitos cardiacos, o utilizado para visualizar la distribución celular de la ER, se han demostrado. Comprensión de la distribución y organización de estos componentes celulares es de vital importancia en la comprensión de la iniciación, traducción y en última instancia la función de muchas Ca2 +-cascadas de señales dependientes. Por ejemplo, canales de Cav1.2 son fundamentalmente importantes para la excitación-contracción de acoplamiento, mientras que la mediada por receptor Ca2 + lanzamiento de ER es quizá el más ubicua cascada de señalización en células de mamíferos.
La reciente explosión de las tecnologías que permiten la proyección de imagen más allá del límite de difracción han ofrecido nuevas ventanas en las complejidades de células de mamífero en el espacio y el tiempo. Estas tecnologías incluyen tormenta STED, Palma, GSD, SIM y sus variantes (p. ej., dSTORM, FPALM). El ingenio de los científicos detrás de estas técnicas nos ha permitido sortear las limitaciones impuestas por las leyes de la física que rigen la difracción de la luz. A pesar de este enorme…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por una subvención de la AHA para R.E.D. (15SDG25560035). Autores desean reconocer el Dr. Fernando Santana para el uso de su microscopio 3D de Leica SR GSD y el Dr. Johannes Hell por proporcionar amablemente el anticuerpo de la FP1.
KOH | Thermo Scientific | P250-500 | To clean coverglass |
#1.5 coverglass 18 x 18 mm | Marienfeld Superior | 0107032) | To grow/process/image cells |
10X PBS | Thermo Scientific | BP3994 | Dilute to 1X with de-ionized water |
Poly-L-Lysine | Sigma | P4832 | Aids with cell adhesion to cover glass |
laminin | Sigma | 114956-81-9 | Aids with cell adhesion to cover glass |
Medium 199 | Thermo Scientific | 11150-059 | Ventricular myocyte culture media |
DMEM 11995 | Gibco | 11995 | Cell culture media |
Fetal bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10437028 | Media supplement |
Penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | Media supplement |
0.05% trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CL | Cell culture solution |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transient transfection reagent |
Ca2+-free PBS | Gibco | 1419-144 | Cell culture |
100 % Methanol | Thermo Fisher Scientific | A414-4 | Cell Fixation |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell Fixation |
Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | SLBR6504V | Cell Fixation |
SEAblock | Thermo Scientific | 37527 | BSA or other blocking solution alternatives exist |
Triton-X 100 | Sigma | T8787 | Detergent to permeabilize cells |
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1) | Gift | N/A | Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003) |
Mouse monoclonal anti-RFP | Rockland Inc. | 200-301-379 | Primary antibody |
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A31573 | Secondary antibody |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen (Thermo Scientific) | A11031 | Secondary antibody |
Sodium azide | Sigma | S2002 | Prevents microbial growth for long term storage of samples |
Catalase | Sigma | C40 | Photoswitching buffer ingredient |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Photoswitching buffer ingredient |
Tris | Sigma | T6066 | Photoswitching buffer ingredient |
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride | Fisher | BP2664100 | Photoswitching buffer ingredient |
β-mercaptoethanol | Sigma | 63689 | Photoswitching buffer ingredient |
NaCl | Fisher | S271-3 | Photoswitching buffer ingredient |
Dextrose | Fisher | D14-212 | Photoswitching buffer ingredient |
Glass Depression slides | Neolab | 1 – 6293 | To mount samples |
Twinsil | Picodent | 13001000 | To seal coverglass |
sec61β-mCherry plasmid | Addgene | 49155 | |
Leica SR GSD 3D microscope | Leica | ||
ImageJ | |||
Washing block solution | 20 % SEAblock in PBS | ||
Primary antibody incubation solution | 0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS | ||
Secondary antibody incubation solution | 1:1000 in PBS |