인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드의 질량 spectrometric 분석 하는 방법을 제시 합니다. 채용 함으로써 분자량 컷오프 필터링, 크로마 사전 분류, 대량 spectrometric 분석 및 펩 티 드 식별 전략의 후속 조합, 그것은 거의 10 배 비해 알려진된 CSF peptidome 확장 가능 이전 연구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)에 내 인 성 펩 티 드를 식별 하기 위해 개발 하는 방법을 설명 합니다. 이 위해 이전 개발된 방법 분자량 컷오프 (MWCO) 여과에 기반 하 고 대량 spectrometric 분석 오프 라인 높은 pH 역 상 HPLC 사전 분류 단계와 결합 되었다.
CSF로 분 비 중추 세포에 의해 창 고 분자의 제거를 위한 주요 통로 이다. 따라서, 중앙 신경 시스템에 많은 프로세스 CSF, 그것에 게 귀중 한 진단 유체 렌더링에 반영 됩니다. CSF는 8-9 배나의 농도 범위에 걸쳐 있는 단백질을 포함 하는 복잡 한 구성, 있다. 단백질, 게다가 이전 연구 또한 내 인 성 펩 티 드의 많은 수의 존재를 증명 하고있다. 단백질 보다 덜 광범위 하 게 공부 하는 동안이 또한 생체로 잠재적인 관심을 고정할 수 있습니다.
내 인 성 펩 티 드 MWCO 여과 통해 CSF 단백질 함량에서 분리 되었다. 샘플에서 대부분의 단백질 콘텐츠를 제거 하 여 공부 샘플 볼륨 및 그로 인하여 또한 내 인 성 펩 티 드의 총 금액 증가 가능 하다. 침투 펩 티 드 혼합물의 복잡성 역 위상 LC MS 분석 전에 알칼리 pH에서 (RP) HPLC 사전 분류 단계를 포함 하 여 해결 했다. 분류는 결합 되었다 60 분수 12에 풀링된 했다 간단한 연결 계획, 분석 시간 소비 함으로써 감소 될 수 있었다 아직도 크게 공동 차입을 피하고 있는 동안.
자동화 된 펩 티 드 식별 3 가지 펩타이드/단백질 식별 소프트웨어 프로그램을 사용 하 고 이후 결과 결합 하 여 수행 되었다. 다른 프로그램 보완 보다는 세 사이 겹쳐 식별의 15%와 비교 했다.
서론
뇌 척추 액체 (CSF)에서 생체 신경 퇴행 성 질환으로 현재 연구를 변형 시키고 있다. 전세계1,2, 펩 티 드 아 밀 로이드 베타 단백질 타우 microtubule 안정화의 구성 된 바이오 마커 triplet 사람들은 Alzheimer의 질병, 60 백만 이상에 영향을 미치는 가장 일반적인 신경 장애, 그리고 phosphorylated 타우 형태, 높은 감도와 특이성, 질병을 검색할 수 있습니다 및 진단 연구 조건3에 포함 되었습니다. 다른 신경 퇴행 성 질환, 파 킨 슨 병, 다 발성 경화 증 등에서 proteomic 연구의 일부는 현재 임상 연구4,5 에서에서 평가 받고 있다 수많은 바이오 마커 후보 식별 6.
CSF에는 단백질, 함께 내 인 성 펩 티 드7,8,9
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프로토콜
아래에 설명 된 프로토콜은 많은 양의 내 인 성 펩 티 드 인간 CSF15에 발견 했다 이전 연구에서 사용 되는 것의 세련 된 버전입니다. 원래 프로토콜에 대 한 업데이트 CSF의 화학 사전 처리에 사소한 변경 뿐만 아니라 오프 라인 높은 pH RP HPLC 사전 분류에 사용 되는 그라데이션의의 최적화를 포함 한다.
윤리적인 고려 사항
스웨덴 환자 및 제어 자료의 모든 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다: 세인트 예란 (참고 2005-554-31/3). 암스테르담 치 매 코 호트에서 CSF 샘플 및 신경과 신경외과, 런던 국립 병원에서 수집 된 샘플 모든 참여 환자 로부터 서 면된 동의와 승인 지역 윤리 위원회에서 연구를 위해 사용 되었다. 여기 주로 활용 자료 진단 목적 샘플에서 왼쪽 위에 CSF 이루어져 있고 우리의 연구에 포함 되 고 전에 취소 확인 했다. 다시 개별 기증자 또는 기증자의 그룹 샘플 추적의 아무 가능성도 있다.
1. 인간의 뇌 척추 액체 (CSF)의 추출:
- 허리 빵 꾸 (훈련 된 의사에 의해 수행 되어야 합니다)를 통해 CSF를....
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결과
여기 설명 하는 방법은 적용 되어 있으며 샘플 사전 분류 (표 1)을 도입 하기 전에 세 가지 연구에서 평가. 첫 번째 연구는 MALDI 표적 격판덮개에 CSF 분수를 안보에 대 한 오프 라인 LC를 사용 하 고 730 확인 된 내 인 성 펩 티 드11결과. 두 다음 연구에서 isobaric 라벨 고용 되었다. 케이스/제어에 주로 식별 및 CSF endopeptidome에 프로테옴 잠재적인 생체의 특성에 대 한 동시에 연구24, 두 번째 연구 isobaric labelling에 치료 효과 vivo에서 모니터링 사용 되었다 36 h16이상의 CSF에 펩 티 드 식에서 γ-secretase 억제제의. 케이스/제어 연구에 437 내 인 성 펩 티 드 확인 되었다, 64의 농도와 개인 사이 크게 변경 된와 건강 한 컨트롤. 셋째, 치료 연구, 식별 1798 내 인 성 펩 티 드, 11 모니터링.......
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토론
높은 pH RP HPLC 사전 분류 하는 단계 내 인 성 펩 티 드의 복구에 대 한 이전 개발된 프로토콜 분자량 외11 의 상대 샘플 복잡성을 감소 및 그로 인하여 5-fold 더 큰 허용 공부를 해야 샘플 볼륨. 이, 차례로, 각 분수에 펩 티 드의 부분 집합의 농도 증가 하 고 그로 인하여 낮은 풍부한 펩 티 드는 검출의 기회를 향상.
동시에 3 개의 proteomic 소프트웨어 고용 내 인 성 펩 티 드에 대 한 식별 전략을 수행 하 여 알려진된 CSF endopeptidome 이상 10 확장 가능 했다. 16,395 내 인 성 펩 티 드의 총 시료 풀링된 CSF에 예비 시험에서 확인 되었다. 식별 중 많은 수의 내 인 성 펩 티 드 단백질 신경 장애의 맥락에서 언급 이전에서 파생 했다. 위의 연구에서 확인 된 몇 가지 펩 티 드 현재 우리의 실험실에서 생체로 평가 되 고 있다. 이 프로세스가 합성 analogues 무거운 동위 원.......
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공개 사항
아니 경쟁 관심사, 금융 또는 기타, 작가 사이 보고 되었습니다.
감사의 글
많은 Tanveer Batth와 동료 조언 사전 분류 방법 설정에 대 한 감사 합니다.
이 작품에서 스웨덴 연구 위원회는 Wallström 및 Sjöblom 재단, 총 및 베 Stohne 기초 Stiftelse, 매 그 너 스 Bergwall 재단, Åhlén 재단, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen 염 자금에 의해 지원 되었다 Gamla Tjänarinnor는 크누트와 앨리스 발 렌 버그 재단, Frimurarestiftelsen을 FoU 서쪽 Götalandsregionen.
이 프로젝트에 대 한 자금 지원의 주요 받는 Kaj Blennow, 헨릭 Zetterberg와 요한 Gobom 했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 M 트리에틸암모늄 바이카보네이 | 플루카, 시그마-알드리치 | 17902-100ML | 티브 |
| 8 M 구아니디늄 염산염 | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | 재질 보기 |
| 포름산 | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| 트리플루오르로아세트산 | 시그마-알드리치 | T6508-10AMP | TFA |
| 수산화암모늄 용액 | 시그마-알드리치 | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛과 Ultracel-30 멤브레인 | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO 필터 |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | 진공 매니폴드 |
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| Sequest HT | Thermo | - | 단백질체학 검색 엔진 |
| 피크스 v7.5 | 생물정보학 솔루션(Bioinformatic Solutions Inc.) | - | 단백질체학 검색 엔진 |
| 찬사 PepMap 100, 75 µ m x 2cm, C18, 100 & Aring; 기공 크기, 3 & 마이크로; m 입자 크기 | Thermo Fisher Scientific | 164535 | 트랩 컬럼 (나노 HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µ m x 500mm, 100Å 모공 크기, 2 &마이크로; m 입자 크기 | Thermo Fisher Scientific | 164942 | 분리 컬럼 (나노 HPLC) |
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| XBridge 펩타이드 BEH C18 컬럼, 130 Å, 3.5 &마이크로; m, 2.1mm X 250mm | Waters | 186003566 | 분리 컬럼(마이크로 HPLC) |
참고문헌
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al.
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재인쇄 및 허가
