Müller Glia cel activatie in een Laser-geïnduceerde Retina degeneratie en regeneratie Model in de zebravis
Summary
De zebravis is een populaire diermodel te bestuderen van de mechanismen van Retina degeneratie/regeneratie in gewervelden. Dit protocol beschrijft een methode om gelokaliseerde letsel verstoren het buitenste netvlies met minimale schade aan het innerlijke netvlies veroorzaken. Vervolgens controleren we in vivo de retinale morfologie en de reactie hierop van Müller, glia hele netvlies regeneratie.
Abstract
Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is het levenslang potentieel van het teleost netvlies voor retinale neurogenese en regeneratie na ernstige schade. Onderzoeken van de regeneratie-trajecten in zebrafish zou brengen nieuwe inzichten te ontwikkelen innovatieve strategieën voor de behandeling van retinale degeneratieve ziekten bij zoogdieren. Hierin zijn we gericht op de inductie van een focal laesie aan het buitenste netvlies in volwassen zebrafish door middel van een 532 nm diodelaser. Een gelokaliseerde blessure kunt onderzoek naar biologische processen die tijdens de retina degeneratie en regeneratie rechtstreeks op het gebied van schade plaatsvinden. Met behulp van niet-invasieve optische coherentie tomografie (OCT), konden we de locatie van het beschadigde gebied en monitor volgende regeneratie definiëren in vivo. Inderdaad, OCT imaging produceert met hoge resolutie, transversale beelden van het netvlies van de zebravis, het verstrekken van informatie die eerder alleen beschikbaar met histologische analyses was. Om te bevestigen de gegevens uit real-time LGO, histologisch secties werden uitgevoerd en regeneratieve reactie na de inductie van de retinale schade werd onderzocht door immunohistochemie.
Introduction
Visie is waarschijnlijk de meest essentiële betekenis van de mens en zijn bijzondere waardevermindering heeft een hoge sociaal-economische gevolgen. In de geïndustrialiseerde wereld goed retinale degeneratieve ziekten voor de meerderheid van gezichtsverlies en blindheid onder de volwassen bevolking1. Retinitis pigmentosa (RP) is de meest voorkomende erfelijke oorzaak van blindheid bij mensen tussen de leeftijden van 20 en 60, die ongeveer 1,5 miljoen mensen wereldwijd2,3. Het is een heterogene familie van overgenomen retinale aandoeningen gekenmerkt door progressieve verlies van de researchdieren (PRs) gevolgd door degeneratie van het retinale pigment epitheel en, vervolgens, gliosis en remodeling van innerlijke neuronen4. Het verloop van de ziekte kan worden verklaard door de incrementele verlies van de twee PR celtypes, meestal beginnend met staven, die verantwoordelijk zijn voor Achromatische visie in het schemerige licht en kegels, die essentieel zijn voor kleur visie en gezichtsscherpte5. Een enkel gen-defect is voldoende om het veroorzaken van RP. Tot nu toe zijn meer dan 130 mutaties in meer dan 45 genen geassocieerd met de ziekte6. Dit leidt tot verschillende fenotypes van de ziekte en is een van de redenen dat gentherapie niet-gegeneraliseerd is en dus een ingewikkelde therapeutische aanpak. Daarom is er dringend behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe algemene therapeutische benaderingen voor de behandeling van retinale degenerations in verblindende ziekten.
Retina degeneratie vaak gaat om PR verlies; Dus, de dood van de cel van de PR is een kenmerk van de degeneratieve processen in de retina-7. Het is al gebleken dat de dood van de cel van de PR Müller glia cellen (MC) activering en proliferatie8 stimuleert. MCs, het grote gliale celtype in het netvlies van gewervelde, werden ooit beschouwd als niets meer dan een “lijm” tussen retinale neuronen. In de afgelopen jaren hebben veel studies aangetoond dat MCs fungeren als meer dan louter structurele steun9. Onder de verschillende functies, MCs ook deelnemen aan de neurogenese en repareren van10. Inderdaad, in antwoord op diffusible factoren van de degenererende netvlies, MCs aanzienlijk verhogen gliale fibrillary zuur eiwit (GFAP) expressie. GFAP etikettering kan dus worden gebruikt als een marker voor MC activering als een secundaire reactie op netvlies letsel en degeneratie11.
Onlangs, ontwikkelden we een nieuwe aanpassing van focal letsel met behulp van een laser voor het opwekken van Retina degeneratie in zebrafish (Danio rerio). Focal letsel is voordelig voor de studie van bepaalde biologische processen zoals de migratie van de cellen in de plaats van de gewonden en de precieze timing van gebeurtenissen die tijdens de retinale regeneratie12 plaatsvinden. Bovendien, de zebravis belangrijker geworden in het visuele onderzoek vanwege de overeenkomsten tussen het visuele systeem en dat van andere gewervelde dieren. Bruto morfologische en histologische kenmerken van menselijke en teleost retinae weer enkele verschillen. Dienovereenkomstig, mens en zebrafish retinae bevatten de dezelfde grote cel klassen georganiseerd in gelaagde hetzelfde patroon, waar licht-sensing researchdieren de buitenste laag, bezetten terwijl het netvlies projectie neuronen, de peesknoopcellen, bevinden zich in het binnenste veld neuronale laag, proximale aan de lens. Het netvlies interneuronen, amacrine, bipolaire, en horizontale cellen, localiseren tussen de fotoreceptor en de ganglion cel lagen13. Bovendien is het netvlies zebrafish kegel gedomineerde en dus dichter bij het menselijke netvlies dan, bijvoorbeeld, het intensief bestudeerde knaagdier netvlies. Een fascinerende verschil tussen teleost en zoogdieren is de aanhoudende neurogenese in vis netvlies en netvlies regeneratie na beschadiging. MCs kunnen zebrafish, dedifferentiate en bemiddelen van regeneratie in benadeelde netvlies14,15. In kip hebben MCs sommige capaciteit ook tot Re-Enter de celcyclus en dedifferentiate. Na retinale letsel in volwassen vis, MCs nemen bepaalde kenmerken van voorlopercellen en stamcellen, migreren naar het beschadigde retinale weefsel en produceren van nieuwe neuronen16. Onverwachte overeenkomsten met retinal progenitoren gen expressie profilering van zoogdieren MCs geopenbaard en bewijs voor intrinsieke neurogene potentieel voor MCs in kip, knaagdieren, en zelfs menselijke netvlies groeit17. Echter is waarom de regeneratieve reactie in vogels en zoogdieren is beduidend goedkoper in vergelijking met de robuuste reactie in vis nog niet begrepen. Daarom begrijpen de endogene herstelmechanismes in zebrafish kan stellen voor strategieën voor stimulerende retinale regeneratie bij zoogdieren en mensen. Met betrekking tot de regeling van de endogene reparatie voor MCs als een therapeutisch instrument voor de behandeling van patiënten met Retina degeneratie zou een uitstekende gevolgen voor onze maatschappij hebben.
Hierin bieden we de stappen die nodig zijn om het model van de degeneratie/regeneratie in ophthalmic onderzoek in dienst. We gericht eerst op inducerende focal schade in de hormoonfuncties retina, dan op de beeldvorming van gebeurtenissen op de site van de schade, en ten slotte visualiseren betrokkenheid van de aangrenzende MCs te ontwikkelen. Het algemene protocol is relatief gemakkelijk uit te voeren en een breed scala aan mogelijkheden voor de evaluatie van het netvlies daarna opent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Netvlies regeneratie/degeneratie in de zebravis is onderzocht door verschillende benaderingen zoals cytotoxin-gemedieerde cel dood22, mechanische schade23en thermische schade24. We een 532 nm diodelaser om schade aan het netvlies zebrafish in dienst. Daarmee is ons model biedt diverse voordelen. Bijvoorbeeld, we snel gemaakt een welomschreven gebied van verwonding gelokaliseerd in de buitenste retina, specifiek in de PRs-laag. Bovendien, deze experim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Martin Zinkernagel, MD, PhD en Miriam Reisenhofer, PhD voor haar wetenschappelijke bijdrage tot stand te brengen van het model en Federica Bisignani voor haar uitstekende technische bijstand.
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
