म्यूलर Glia सेल सक्रियकरण में एक लेजर प्रेरित रेटिना अध-पतन और Zebrafish में मॉडल पुनर्जनन
Summary
zebrafish रीढ़ में रेटिना अध कि उत्थान/पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय पशु मॉडल है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि स्थानीयकृत भीतरी रेटिना को ंयूनतम क्षति के साथ बाहरी रेटिना में खलल डालने चोट प्रेरित करने के लिए । बाद में, हम में रेटिना पुनर्जनन और म्यूलर glia प्रतिक्रिया विवो में निगरानी.
Abstract
teleost और स्तनधारियों के बीच एक आकर्षक अंतर रेटिना neurogenesis और गंभीर क्षति के बाद पुनर्जनन के लिए teleost रेटिना की आजीवन क्षमता है । zebrafish में पुनर्जनन रास्ते की जांच नए अंतर्दृष्टि लाने के लिए स्तनधारियों में रेटिना अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए अभिनव रणनीतियों का विकास हो सकता है । इस के साथ साथ, हम एक ५३२ एनएम डायोड लेजर के माध्यम से वयस्क zebrafish में बाहरी रेटिना के लिए एक फोकल घावों की प्रेरण पर ध्यान केंद्रित किया । एक स्थानीयकृत चोट जैविक प्रक्रियाओं है कि रेटिना अध-पतन और नुकसान के क्षेत्र में सीधे उत्थान के दौरान जगह लेने की जांच की अनुमति देता है । गैर इनवेसिव ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग (अक्टूबर), हम क्षतिग्रस्त क्षेत्र के स्थान को परिभाषित करने और vivo में बाद में पुनर्जनन की निगरानी करने में सक्षम थे । दरअसल, अक्टूबर इमेजिंग उच्च संकल्प, पार zebrafish रेटिना के अनुभागीय छवियों का उत्पादन, जानकारी है जो पहले ही ऊतकीय विश्लेषण के साथ उपलब्ध था प्रदान करते हैं । आदेश में वास्तविक समय OCT से डेटा की पुष्टि करने के लिए, ऊतकीय वर्गों प्रदर्शन किया गया और रेटिना की चोट के प्रेरण immunohistochemistry द्वारा जांच की गई के बाद reअपक्षयी प्रतिक्रिया ।
Introduction
दृष्टि शायद मनुष्य की सबसे आवश्यक भावना है और उसकी हानि का उच्च सामाजिक-आर्थिक प्रभाव पड़ता है । औद्योगिक दुनिया में, रेटिना अपक्षयी रोगों दृष्टि हानि और दृष्टिहीनता वयस्क जनसंख्या1के बीच के बहुमत के लिए खाते । रेटनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) 20 और ६० की उंर के बीच लोगों में अंधापन के सबसे आम विरासत का कारण है, लगभग १,५००,००० लोगों को दुनिया भर में2,3प्रभावित । यह विरासत में मिली रेटिना विकारों के एक विषम परिवार है photoreceptors (पीआरएस) के प्रगतिशील नुकसान की विशेषता रेटिना वर्णक उपकला के अध-पतन के बाद और, बाद में, gliosis और इनर न्यूरॉन्स की remodeling4. रोग के पाठ्यक्रम के दो पीआर कोशिका प्रकार, आमतौर पर छड़ है, जो मंद प्रकाश में achromatic दृष्टि के लिए जिंमेदार है के साथ शुरू करने के वृद्धिशील नुकसान से समझाया जा सकता है, और शंकु, जो रंग दृष्टि और दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक है5। एक एकल जीन दोष आरपी पैदा करने के लिए पर्याप्त है । अब तक ४५ से अधिक में १३० उत्परिवर्तनों से अधिक जीन रोग के साथ संबद्ध किया गया है6। यह रोग phenotypes बदलती है और एक कारण है कि जीन थेरेपी गैर-सामांयीकरण और इस प्रकार एक जटिल चिकित्सीय दृष्टिकोण है । इसलिए, वहाँ एक तत्काल नए सामान्य चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए अंधा कर रही रोगों में रेटिना अध कि इलाज के लिए आवश्यक है ।
रेटिना अध: पतन अक्सर पीआर नुकसान शामिल है; इसलिए, पीआर सेल मौत रेटिना7में अपक्षयी प्रक्रियाओं की एक बानगी है । यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि पीआर सेल मौत म्यूलर glia सेल (MC) सक्रियण और8जखीरे उत्तेजित करता है । MCs, हड्डीवाला रेटिना में प्रमुख glial कोशिका प्रकार, एक बार रेटिना न्यूरॉन्स के बीच एक “गोंद” से अधिक कुछ नहीं माना जाता था. हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से पता चला है कि MCs मात्र संरचनात्मक समर्थन से अधिक के रूप में कार्य9। विभिंन कार्यों के अलावा, MCs neurogenesis में भी भाग लेते है और10मरंमत । दरअसल, चूकने रेटिना से diffusible कारकों के जवाब में, MCs काफी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) अभिव्यक्ति में वृद्धि. इसलिए, GFAP ्र रेटिना चोट और अध11के लिए एक द्वितीयक प्रतिक्रिया के रूप में MC सक्रियण के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
हाल ही में, हम फोकल एक लेजर का उपयोग कर चोट के एक उपंयास अनुकूलन विकसित zebrafish (ढाणियो rerio) में रेटिना अध-पतन के लिए प्रेरित करने के लिए । फोकल चोट कुछ जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लाभप्रद है जैसे कि कोशिकाओं के घायल स्थल में प्रवास और घटनाओं है कि रेटिना पुनर्जनन12के दौरान जगह ले के सटीक समय । इसके अलावा, zebrafish क्योंकि अपने दृश्य प्रणाली और अंय रीढ़ के बीच समानता के दृश्य अनुसंधान में महत्वपूर्ण हो गया है । सकल रूपात्मक और मानव और teleost रेटिना प्रदर्शन के ऊतकीय सुविधाओं के कुछ मतभेद । तदनुसार, मानव और zebrafish रेटिना एक ही स्तरित पैटर्न में आयोजित एक ही प्रमुख सेल वर्ग होते हैं, जहां प्रकाश संवेदन photoreceptors बाहरी परत पर कब्जा है, जबकि रेटिना प्रक्षेपण ंयूरॉंस, नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं, अंतरतम में रहते है न्यूरॉन परत, लेंस के समीपस्थ. रेटिना न्यूरॉन्स, amacrine, द्विध्रुवी, और क्षैतिज कोशिकाओं, photoreceptor और नाड़ीग्रंथि सेल परतों के बीच में स्थानीयकरण13. इसके अलावा, zebrafish रेटिना शंकु-प्रभुत्व है और इसलिए से मानव रेटिना के करीब है, उदाहरण के लिए, गहन रूप से कुतर रेटिना का अध्ययन किया । teleost और स्तनधारियों के बीच एक दिलचस्प अंतर मछली रेटिना में लगातार neurogenesis और क्षति के बाद रेटिना पुनर्जनन है । zebrafish में, MCs में अंतर कर सकते है और मध्यस्थता पुनर्जनन घायल रेटिना में14,15। चिकन में, MCs कुछ क्षमता भी फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने के लिए और अंतर करने के लिए है । वयस्क मछली में रेटिना की चोट के बाद, MCs जनक और स्टेम कोशिकाओं की कुछ विशेषताओं को अपनाने, क्षतिग्रस्त रेटिना ऊतक के लिए पलायन और नए ंयूरॉंस16उत्पादन । जीन अभिव्यक्ति स्तनधारी MCs की रूपरेखा रेटिना progenitors के लिए अप्रत्याशित समानताएं पता चला, और चिकन में MCs की आंतरिक तंत्रिकाजन्य क्षमता के लिए सबूत, कुतर, और यहां तक कि मानव रेटिना17बढ़ रही है । फिर भी, क्यों पक्षियों और स्तनधारियों में अपक्षयी प्रतिक्रिया कम है मछली में मजबूत प्रतिक्रिया के साथ तुलना में अभी तक समझ में नहीं है । इसलिए, zebrafish में अंतर्जात मरंमत तंत्र को समझना स्तनधारियों और मनुष्यों में रेटिना पुनर्जनन उत्तेजक के लिए रणनीतियों का सुझाव हो सकता है । रेटिना अध-पतन के साथ रोगियों के उपचार के लिए एक चिकित्सीय उपकरण के रूप में MCs के अंतर्जात मरंमत तंत्र को रोजगार हमारे समाज के लिए एक उत्कृष्ट प्रभाव होता है ।
साथ ही, हम नेत्र अनुसंधान में अध/पुनर्जनन मॉडल को रोजगार के लिए आवश्यक कदम प्रदान करते हैं । हम neurosensory रेटिना में फोकल क्षति उत्प्रेरण पर पहले ध्यान केंद्रित किया, तो चोट साइट पर विकसित करने की घटनाओं की इमेजिंग पर, और अंत में आसंन MCs की भागीदारी visualizing । जनरल प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान है और बाद में रेटिना के मूल्यांकन के लिए संभावनाओं की एक विस्तृत विविधता को खोलता है ।
Protocol
सभी प्रयोगों की दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के नेत्र और विजन अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए बयान का पालन और सरकारी अधिकारियों के संबंधित नियमों का सम्मान.
…
Representative Results
Discussion
रेटिना पुनर्जनन/zebrafish में अध कि cytotoxin-मध्यस्थ सेल मौत22, यांत्रिक चोट23, और थर्मल चोट24के रूप में विभिन्न दृष्टिकोण से जांच की गई है । हम एक ५३२ एनएम डायोड लेजर zebrafish रेटिना को नुकसान का…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम धंयवाद मार्टिन Zinkernagel, एमडी, पीएचडी और मरियम Reisenhofer, उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मॉडल और फेडरिका Bisignani की स्थापना पर उसे वैज्ञानिक इनपुट के लिए पीएचडी ।
Materials
| Acid hematoxylin solution | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G aqueous solution 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11008 | |
| Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrogel contact lens | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a. | 1-Day Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a. | Methocel 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a. | 532 nm laser |
| Mouse anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT Imaging System | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Spectralis |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a. | Version 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| Silicone pin holder | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly. |
| Slit lamp BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| Slit lamp adapter | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a. | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D non-contact slit lamp lens | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular fundus laser lens | Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom | R2100-EU | Steamer |
References
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms. Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).
- Berson, E. L. Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).
- Strettoi, E. A Survey of Retinal Remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 494 (2015).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
- Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications. Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).
- Pierce, E. A. Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations. BioEssays. 23, 605-618 (2001).
- Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury. Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).
- Newman, E., Reichenbach, A. The Müller cell: a functional element of the retina. Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).
- Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates. Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).
- Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats. Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).
- DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).
- Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
- Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina. Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).
- Xia, X., Ahmad, I. Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia. Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , 7-38 (2002).
- Riepe, R. E., Norenburg, M. D. Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina. Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).
- Derouiche, A., Rauen, T. Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance. J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).
- Bignami, A., Dahl, D. The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).
- Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).
- Cameron, D. A., Carney, L. H. Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly. J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).
- Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Dev Biol. 6, 36 (2006).
- Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).
- Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits. Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).
- Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat. Vision Res. (2), 223-234 (2008).
- Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J Vis Exp. (80), e51017 (2013).
