Zebrafish는 척추 동물의 망막 변성/중생의 메커니즘 연구 인기 동물 모델입니다. 이 프로토콜에서는 내부 망막에 최소한의 손상으로 외부 망막을 방해 하는 지역화 된 상해를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 망막 형태학 및 망막 재생 내내 뮐러 명과 응답 이후, vivo에서 모니터링합니다.
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이 논문에서
요약
초록
매혹적인 차이 teleost 및 포유류 망막 신생 및 심각한 손상 후 재생 teleost 망막의 평생 가능성은. Zebrafish에 재생 경로 조사 포유류에서 망막 퇴행 성 질환의 치료를 위한 혁신적인 전략을 개발 하는 새로운 통찰력을가지고 있습니다. 여기, 우리는 532 nm 다이오드 레이저에 의하여 성인 zebrafish에 외부 망막에 초점 병 변의 유도에 집중 했다. 지역화 된 부상 망막 변성 및 손상의 지역에서 직접 재생 하는 동안 자리를 차지할 생물 학적 프로세스를 조사 하 고 있습니다. 비-침략 적 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)를 사용 하 여, 우리는 손상 된 지역 및 모니터 후속 중생의 위치를 정의 하 수 있었다 vivo에서. 실제로, 10 월 영상만 사용할 수 있었던 이전 조직학 분석 정보를 제공 하는 제 브라 망막의 고해상도, 단면 이미지를 생성 합니다. 조직학 단면도 수행한 실시간 10 월에서 데이터를 확인, 그리고 망막 상해의 유도 후 재생 응답 immunohistochemistry에 의해 조사 되었다.
서론
비전 아마 인간의 가장 필수적인 의미 이며 그 장애는 높은 사회 경제 충격. 공업화 한 세계에서 망막 퇴행 성 질병 시력 손실과 실명 성인 인구1중의 대다수를 위한 계정. 망막 화 (RP)에 영향을 미치는 약 1.5 백만 사람들 전세계2,360와 20의 나가 사이 사람들에서 실명의 가장 일반적인 상속 된 원인입니다. 그것은 상속 된 망막 장애 망막 안료 상피 하 고, 그 후, gliosis의 변성 및 내부 신경4개조 (PRs) 대뇌의 진보적인 손실에 의해 특징의 다른 유형의 가족. 질병의 과정 봉, 희미 한 빛에 콘, 컬러 비전 및 시력5에 필수적인 색 비전에 대 한 책임은 일반적으로 시작 하는 두 홍보 세포 유형에의 증분 손실에 의해 설명 될 수 있다. 단일 유전자 결함은 RP를 일으킬 충분 합니다. 지금까지 45 유전자에서 130 개 이상의 돌연변이 질병6와 연결 되었습니다. 이 다양 한 질병 고기 리드 이며 유전자 치료는 비 일반화할 이유 중 하나 이렇게 복잡 한 치료 접근. 그러므로, 망막 유년에 눈부신 질병 치....
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프로토콜
모든 실험 성명 안과 및 안과 (ARVO)에 비전 연구를 위한 협회의 비전 연구에서 동물 사용에 대 한 준수 하 고 존중 하는 정부 기관의 관련된 규정.
1. 동물
- 유지 TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) 스트레인 26.5 ° C의 온도와 물 표준 조건 하에서 6-9 개월 ~ 14/10 h 명암 주기 18 세.
- 정부 당국에 의해 승인 후 동물 실험에 대 한 관련 기관의 동물 보호 지침을 따릅니다.
2. 가역 전신 마 취
- 준비 물 탱크 그리고 트리 스의 1 M의 2.1 mL 97.9 ml tricaine 분말의 400 밀리 그램을 용 해 하 여 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 (tricaine)의 재고 솔루션 버퍼링 식 염 수 (TBS). 어둠 한 달에에서 4 ° C에서 1 M Tris (pH 9)와 저장소 pH 7.0 조정.
참고: Tricaine는 동물의 자연 생활 상태 처럼 물에 준비 되어야 한다, 원래 탱크 물 사용 하는 선호. - 재고 솔루션 1시 25분 탱크 물에 희석 ....
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결과
실시간 10 월: 망막 수리에 MCs의 역할 분석, 우리 zebrafish 망막에 손상의 잘 delineated 영역 유도 레이저 부상 모델 사용. 손상의 사이트 했다 vivo에서 10 월 처음으로 (0 일) 부상 (그림 3)에 따라 60 분 이내에 의하여 몇 군데. 물고기 눈의 광학에 대 한 보상, 맞춤 콘택트 렌즈는 각 막에 배치 했다. 레이저 치료 후 즉시 확산 하이퍼 반사 신호 외부 망막 (화살표)에 지역화 되었습니다. 그것은 외부 plexiform 레이어 (OPL) 망막 안료 상피 (RPE)에서 연장. 유사한 신호는 또한 1 일에 감지. 3 일 후이 확산 신호는 더 조직 되 고 밀도 되었다. 그것은 지속적으로 외부 핵 층 (ONL) 포토 리셉터 레이어로 확장에 보였다. 첫 주 (7 일)에 따라 평균 병 변 크기에 상당한 감소와만 작은 하이퍼 반사 신호 감지 되었습.......
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토론
제 브라에서 망막 재생/변성 cytotoxin 중재 세포 죽음22, 기계적 상해23, 열 상해24등 다른 방법으로 조사 되었습니다. 우리 고용 zebrafish 망막 손상 532 nm 다이오드 레이저. 따라서, 우리의 모델 몇 가지 장점을 제공합니다. 예를 들어, 우리는 급속 하 게 외부 망막, PRs 계층에서 특히에 상해의 잘 정의 된 영역을 만들었습니다. 또한,이 실험 설정 안 neovascularization를 유도 Bruch의 막 손상에 의해, 예를 들어 다른 생물 학적 과정을 공부 하는 손상의 더 큰 영역을 생산 하기 위해 수정할 수 있습니다. 최소한의 피해 이며 재생 응답의 타이밍은 정확 하 게 그리고 reproducibly 변조 될 수 있습니다.
Phenotypical 변화 시간이 지남에 따라, 우리는 하이델베르크 Spectralis 시스템.......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리가 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 모델 및 Federica Bisignani 설정에서 그녀의 과학적인 입력에 대 한 마틴 Zinkernagel, 메릴랜드, 박사 학위 및 Reisenhofer, 박사 미리 암 감사 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 산성 헤마톡실린 용액 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2852 | |
| 알부민 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A07030 | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 5470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI 마운팅 매체 | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin G 수용액 0.5% | Carl Roth, Arlesheim, Switzerland | X883.2 | |
| 에탄올 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | |
| 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, 스위스 | ED | |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| 염소 안티 토끼 IgG H & L 알렉사 플루오® 488 | Life Technologies, Zug, 스위스 | A11008 | |
| 염소 안티 마우스 IgG H& L 알렉사 플루오® 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11020 | |
| 염소 노멀 세럼 | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| 하이드로겔 콘택트렌즈 | Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland | n.a.1-Day | Acuvue Moist |
| Hydroxypropylmethylcellulose 2% | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | n.a.Methocel | 2% |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A5040 | Tricaine, MS-222 |
| Visulas 532s | Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany | n.a.532nm | 레이저 |
| 마우스 anti-GS monoclonal antibody | Millipore, Billerica, MA, USA | MAB302 | |
| HRA + OCT 이미징 시스템 | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a.Spectralis | |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany | n.a.Version | 1.9.10.0 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Rabbit anti-GFAP polyclonal anti anti GFAP polyclonal antibody | Invitrogen, Waltham, MA, USA | 180063 | |
| 실리콘 핀 홀더 | Huco Vision AG Switzerland | n.a. | 살균 트레이의 실리콘 핀 매트에서 손으로 자릅니다. |
| 슬릿 램프 BM900 | Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland | n.a. | |
| 슬릿 램프 어댑터 | Iridex Corp., Mountain View, CA, USA | n.a.Superfrost | |
| Plus 유리 슬라이드 | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain | KIT, Karlsruhe, Germany | 15204 | http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3 |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| 78D 비접촉 슬릿 램프 렌즈 | Volk Optical, Mentor, OH, USA | V78C | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Ocular Fundus laser | lens Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA | OFA2-0 | |
| 2100 Retriever | Aptum Biologics Ltd., 사우샘프턴, 영국 | R2100-EU | 스티머 |
참고문헌
- Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).
- Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. Retin....
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